UPLC法測(cè)定黃蒲通竅膠囊中二苯乙烯苷的含量

洪 燕 ，韓燕全 ，陳 楊 ，蕭 偉

（1.安徽中醫(yī)學(xué)院，安徽合肥230031； 2.安徽中醫(yī)學(xué)院第一附院，國(guó)家中醫(yī)藥管理局中藥制劑三級(jí)實(shí)驗(yàn)室，安徽合肥230031；3.江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司，中藥制劑過(guò)程新技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇連云港222001）

黃蒲通竅膠囊為安徽中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院的醫(yī)院制劑，是本院神經(jīng)內(nèi)科經(jīng)長(zhǎng)期臨床實(shí)踐研制的治療血管性癡呆的口服膠囊制劑，具有益氣補(bǔ)腎、豁痰化瘀之功效，在臨床使用了近十余年［1］。黃蒲通竅膠囊處方由大黃、制首烏、石菖蒲等六味中藥組成，其中制首烏是該方的主藥之一。近年研究表明，制首烏中所含二苯乙烯苷為其主要有效成分之一，具有腦保護(hù)、抗衰老、降低膽固醇和保肝等作用［2-3］。本研究選取二苯乙烯苷為指標(biāo)，建立超高效液相色譜法（UPLC）檢測(cè)方法，為更好地控制該膠囊的質(zhì)量提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器

Waters Acquity H-Class UPLC超高效液相色譜儀，包括四元高壓梯度泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、二極管陣列檢測(cè)器以及Empower 2數(shù)據(jù)處理工作站；AG285型電子分析天平（德國(guó)賽多利斯公司）；水浴鍋；電熱套；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；真空干燥箱；KQ3200DB型超聲儀。

1.2 藥物與試劑

黃蒲通竅膠囊由安徽中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院中藥制劑三級(jí)實(shí)驗(yàn)室提供，（批號(hào)分別是111015、111117 和 111128）；2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-D葡萄糖苷對(duì)照品（批號(hào)為110844-201109，供含量測(cè)定用，購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所）；甲醇、乙腈均為色譜純（美國(guó)Tedia公司）；水為屈臣氏蒸餾水；其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

參照文獻(xiàn)［4-5］HPLC法進(jìn)行改進(jìn)，得到本色譜條件。色譜柱為Acquity BEH C18柱（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流動(dòng)相為乙腈∶水（17∶83）；檢測(cè)波長(zhǎng)320 nm；柱溫 30℃；流速：0.20 mL/min；進(jìn)樣量 2.0 μL。在上述色譜條件下二苯乙烯苷理論塔板數(shù)大于3 000，分離度大于1.5。陰性供試品、二苯乙烯苷對(duì)照品及供試品UPLC色譜圖見(jiàn)圖1。

2.2 對(duì)照品溶液制備

精密稱取二苯乙烯苷對(duì)照品適量，配制成對(duì)照品母液，精密移取一定體積對(duì)照品制成濃度為0.049 7 g/L的對(duì)照品溶液，過(guò)0.22 μm微孔濾膜，即得。

2.3 供試品溶液的制備

精密稱定膠囊內(nèi)容物0.5 g左右，加入甲醇適量，回流提取30 min，放冷，過(guò)濾，加甲醇定容至10 mL量瓶中，搖勻，過(guò)0.22 μm微孔濾膜，即得。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

自動(dòng)進(jìn)樣對(duì)照品溶液 1 μL、2 μL、3 μL、4 μL、5 μL，按“2.1項(xiàng)下”色譜條件測(cè)定，以色譜峰峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，以進(jìn)樣濃度（X）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并進(jìn)行線性回歸，線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)如下：Y=638 116.3X-200 955.6，r=0.999 8。結(jié)果表明二苯乙烯苷在0.049 7 mg/mL～0.248 5 mg/mL范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.5 精密度實(shí)驗(yàn)

取濃度為0.049 7 g/L的二苯乙烯苷對(duì)照品溶液，自動(dòng)重復(fù)進(jìn)樣6次，每次2 μL，測(cè)得二苯乙烯苷峰面積RSD為1.59%（n=6）。結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取批號(hào)為111117供試品溶液，分別在第0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h，按“ 2.1 項(xiàng)下”色譜條件測(cè)定，測(cè)得樣品中二苯乙烯苷峰面積的RSD為1.46%（n=6），表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

取批號(hào)為111117供試品溶液，平行制備6份供試品溶液，按上述色譜條件測(cè)定峰面積并計(jì)算二苯乙烯苷的含量，其RSD為0.67%（n=6）。

2.8 回收率試驗(yàn)

取已知二苯乙烯苷含量（0.901 mg/g）批號(hào)為111117供試品溶液6份，分別加入二苯乙烯苷對(duì)照品溶液適量，按“2.3”項(xiàng)下樣品溶液的制備進(jìn)行處理，計(jì)算得回收率平均值為98.84%，RSD為2.50%（n=6），結(jié)果見(jiàn)表 1。

表1 加樣回收率測(cè)定結(jié)果 （n=6）

2.9 樣品測(cè)定

將3批樣品制成樣品溶液，按上述色譜條件測(cè)定，結(jié)果批號(hào)111015、111017和111028的黃蒲通竅膠囊含二苯乙烯苷分別為0.930 mg/g、0.901 mg/g和0.913mg/g。

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)采用的UPLC法，具有分析時(shí)間短、分離效率高、重復(fù)性好、準(zhǔn)確簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)。據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，采用HPLC方法測(cè)定二苯乙烯苷成分通常需要測(cè)定20min以上［5］，而本實(shí)驗(yàn)采用UPLC方法用時(shí)4min左右即可完成一次進(jìn)樣，大幅提高了分析速度和效率。

實(shí)驗(yàn)中分別考察了Acquity BEHC18（100mm×2.1 mm，1.7μm）、Acquity BEHC18（50 mm×2.1 mm，1.7μm）和Acquity HSST3（50 mm×2.1mm，1.8μm）三種不同型號(hào)色譜柱，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Acquity BEHC18（50mm×2.1mm，1.7μm）色譜柱對(duì)于所測(cè)的目標(biāo)成分分離度、峰型均較好，且出峰時(shí)間短，故選用該型號(hào)色譜柱。同時(shí)考察了甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸等不同流動(dòng)相的洗脫條件，結(jié)果發(fā)現(xiàn)流動(dòng)相為乙腈∶水（17∶83）對(duì)于所測(cè)目標(biāo)分離度、峰型均較好，無(wú)干擾，故選用該流動(dòng)相。同時(shí)也考察了柱溫及流速，最終以柱溫30℃、流速0.20 mL/min分離效果較好。本實(shí)驗(yàn)所建立的方法快捷、準(zhǔn)確，重復(fù)性好，靈敏度高，可用于黃蒲通竅膠囊的質(zhì)量控制。

［1］陳永華，江停戰(zhàn)，張波，等.黃蒲通竅膠囊治療血管性癡呆的臨床觀察［J］.中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2010，8（1）：41.

［2］趙玲，李雅莉，靳洪濤，等.何首烏提取物對(duì)高膽固醇血癥大鼠學(xué)習(xí)記憶及血脂的影響［J］.中草藥，2004，35（11）：1 277.

［3］王巍，王丹巧.何首烏腦保護(hù)作用機(jī)理的進(jìn)展［J］.中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合雜志，2005，25（10）：955.

［4］國(guó)家藥典委員會(huì).中國(guó)藥典一部［S］.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010.

［5］李志浩，朱雪松，鄭芳，等.高效液相色譜法測(cè)定夜寧糖漿中四羥基二苯乙烯苷的含量［J］.中國(guó)醫(yī)院藥學(xué)雜志，2011，31（2）：170.