阿德福韋酯長期治療對慢性乙型肝炎患者PBMCs中線粒體DNA的影響*

劉曉宇 周 莉 段鐘平 趙彩彥

阿德福韋酯于2002年由美國食品藥品管理局（Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）批準上市用于治療慢性乙型肝炎（CHB），至2008年，全世界服用阿德福韋酯的患者大約為41萬人/年，并于2008年被批準用于12～17歲兒童患者[1]。阿德福韋酯在細胞激酶的作用下被磷酸化為有活性的代謝產(chǎn)物即阿德福韋酯二磷酸鹽，后者通過與自然底物脫氧腺苷三磷酸鹽競爭或是整合到病毒DNA后引起DNA鏈延長終止而發(fā)揮抗病毒作用[2]。一般情況下，阿德福韋酯不會影響人類DNA復制和修復，但若長期應用，隨著藥物濃度的不斷積聚，仍可能對DNA聚合酶γ產(chǎn)生一定的毒性作用。該酶是線粒體復制中的關鍵酶。因此，該酶受損后，勢必會影響到線粒體的數(shù)量和功能。

阿德福韋酯的主要不良反應是可引起腎小管腎病，而腎毒性發(fā)生率與藥物劑量相關。當藥物劑量≥30mg/d時，其腎病的發(fā)生率為22%～50%，而藥物劑量在10mg/d時，其發(fā)生率與安慰劑相似。腎毒性的發(fā)生機制可能與藥物對線粒體的毒性有關[3]。Tanji N等[4]對阿德福韋酯相關性腎損害患者腎臟的超微結構研究發(fā)現(xiàn)，近端小管線粒體腫大、變形，線粒體DNA數(shù)量明顯減少，細胞色素C氧化酶缺乏，細胞氧化和呼吸功能喪失。Izzedine H等[5]認為腎小管部位較高濃度的阿德福韋酯可抑制腎細胞線粒體DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）的合成，從而導致近曲小管mtDNA損耗，線粒體功能明顯降低，影響腎小管的重吸收和分泌功能。嚴重時可導致腎小管細胞凋亡，臨床上表現(xiàn)為近曲小管功能障礙。研究表明，長期服用核苷類似物引起的乳酸酸中毒、脂質代謝紊亂、橫紋肌溶解、胰腺炎和周圍神經(jīng)病變等不良反應均與線粒體病變有關[6～10]。

外周血單個核細胞（peripheral blood monouclear cells，PBMCs）中mtDNA在一定程度上能夠反應組織mtDNA的改變。吳亞松等[11，12]研究指出，發(fā)生脂質代謝紊亂的AIDS患者PBMCs中mtDNA含量比未發(fā)生脂質代謝紊亂的患者顯著降低。由于PBMCs中線粒體較組織中易于獲得，因此可用其來監(jiān)測線粒體的損傷情況。本研究觀察了服用阿德福韋酯3年以上的65例CHB患者PBMCs中線粒體的損傷情況。

資料與方法

一、研究對象 選自2010年7月～2011年3月首都醫(yī)科大學附屬北京佑安醫(yī)院門診就診的未經(jīng)抗病毒治療或接受阿德福韋酯單藥治療的CHB患者，診斷均符合2000年病毒性肝炎防治方案[13]，其中對照組22例，為首次發(fā)病，尚未進行過抗病毒治療（對照組）；阿德福韋酯單藥連續(xù)治療2年組18例（2年組）；阿德福韋酯單藥連續(xù)治療3年組25例（3年組）。排除合并甲、丙、丁、戊型肝炎病毒感染及藥物性、自身免疫性、酒精性肝損害和肝硬化患者。

二、觀察指標 使用OLYMPUS AU5400全自動生化分析儀檢測血生化指標；采用熒光PCR法檢測血清HBV DNA含量（羅氏試劑盒和羅氏COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan48分析儀）；采用ELISA法檢測血漿丙二醛（malondialdehyde，MDA）和F2-isoprostanes含量（上海Blue Gene公司）；采用分光光度法檢測血漿總抗氧化能力（total antioxidant capability，TAOC）含量（南京建成試劑和上海尤尼柯儀器有限公司生產(chǎn)的UV-2600型紫外可見分光光度計）。

三、PBMCs中mtDNA的提取和測定 取9ml EDTA抗凝靜脈血，1h內(nèi)常規(guī)方法分離PBMCs，計數(shù)。取約1×106個細胞，用DNA提取試劑盒（德國 QIAGEN公司）提取DNA，以線粒體編碼的基因細胞色素C氧化酶Ⅱ（coxⅡ）的拷貝數(shù)作為mtDNA拷貝數(shù)，磷酸甘油醛脫氫酶為核DNA（nuclear DNA，nDNA）內(nèi)參照。采用mtDNA/nDNA表示mtDNA含量。其中PCR引物和探針（美國Invitrogen公司）序列為：mtDNA cox II引物：上游5'-TATCTTTTGGCGGTATGCACTTTTAACAGT-3'， 下 游 5'-TGATGAGATTAGTAGTATGGGAGTGG-3'， 探 針 5'-FAM-CACCCCCCAACTAACACATTATTTTCCCC-TAMRA-3'；核DNA引物：上游 5'-GCCATCCTGCGTCTGGACCTGGCT-3'，下 游 5'-TGATGACCTGGCCGTCAGGCAGCTC-3'，探針 5'-FAM-GCCGGGACCTGACTGACTACCTCATGA-TAMRA-3'。試劑購自美國ABi公司，所用儀器為Step One Plus Real-time PCR儀，分析軟件為Step One Plus software（美國AB公司）。

表1 各組人群基線情況

四、統(tǒng)計學處理 計量資料以均數(shù)±標準差表示，采用方差分析法進行組間差異的比較。計數(shù)資料采用x2檢驗或Fisher’s確切概率法進行組間差異的比較。應用SPSS 13.0統(tǒng)計分析軟件，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結果

一、各組人群基線情況 各組患者性別比例、年齡、HBsAg陽性持續(xù)時間的差異均無統(tǒng)計學意義，具有可比性。三組ALT、AST和HBV DNA水平比較，差異有統(tǒng)計學意義（F/2 值分別為 26.972，15.667，16.865，P值分別為0.000，0.000，0.000）。進一步比較服用阿德福韋酯2年和3年組結果顯示，ALT、AST和HBV DNA差異無統(tǒng)計學意義（P值分別為0.716，0.757，0.927，均＞0.05），見表1。

二、3組患者PBMCs中mtDNA水平和有關指標的比較 見表2。

表2 各組有關指標（）的比較

表2 各組有關指標（）的比較

與對照組比，①P＜0.05

血清TAOC（單位/毫升）對照組 1.4±1.2 10.4±6.7 3.7±2.7 4.3±1.8 2年組 0.6±0.4① 8.1±4.7 1.5±0.8① 3.0±1.1①3年組 0.8±0.5① 6.7±3.2 2.2±1.3① 2.3±1.4①F 5.878 2.404 7.300 10.888 P 0.005 0.099 0.001 0.000 PBMCs mtDNA（copies/cell）血清MDA（ng/ml）F2-isoprostanes（ng/ml）

三、不良反應 用藥期間各組患者均未見明顯不良反應。

討論

線粒體是一種半自主細胞器，可獨立于核DNA之外自主地進行復制、轉錄和翻譯。mtDNA由16 569bp組成，編碼2個rRNA基因（16SrRNA，12SrRNA），22個tRNA基因，13個蛋白基因（包括1個細胞色素b基因，2個ATP酶亞單位基因和7個呼吸鏈脫氫酶亞單位基因）。mtDNA能合成自身所需的一部分蛋白質，線粒體中大部分蛋白質是核基因編碼的。閾值效應是指當mtDNA突變達到一定比例時，才會出現(xiàn)受損表型；由于mtDNA缺乏修復系統(tǒng)及組蛋白保護，所以易受活性氧等自由基的侵害而突變率高。mtDNA可通過母系遺傳。線粒體的生命周期有限，平均壽命約為10天，具有較高的更新率，需不斷復制。因此，當藥物濃度高達能夠抑制HBV DNA聚合酶γ時，則會導致線粒體合成減少，從而誘導突變的發(fā)生，但只有當損害達一定程度時才會出現(xiàn)受損表型[17]。

線粒體是細胞內(nèi)氧化磷酸化和形成三磷酸腺苷（ATP）的主要場所，也是調(diào)控細胞凋亡和活性氧產(chǎn)生的重要部位。當線粒體異?；驕p少達一定程度時即可影響其氧化磷酸化功能，使ATP生成減少，活性氧生成增加，出現(xiàn)細胞功能障礙或細胞凋亡。在體外試驗中，許多抗HBV核苷（酸）類似物在高于人體治療劑量10～100倍時可表現(xiàn)出線粒體毒性。

本研究發(fā)現(xiàn)，服用阿德福韋酯2年后，mtDNA含量已經(jīng)減少，但繼續(xù)服用阿德福韋酯1年，mtDNA含量則無進一步下降。已有研究表明，HBV本身會影響線粒體功能。張樹林等[14]研究發(fā)現(xiàn)HBV侵犯PBMCs可致線粒體功能降低，能量代謝異常。Tan C等[15]研究指出HBV復制會引起線粒體膜通透性轉換孔開放，導致鈣外流，引發(fā)細胞凋亡。Lin N等[16]報道HBV可以下調(diào)細胞色素C氧化酶II表達，抑制線粒體細胞色素C氧化酶活性，導致氧自由基產(chǎn)生增多。Stankov MV[17]等在研究核苷（酸）類似物對人皮下脂肪組織中mtDNA缺失和呼吸鏈功能的影響時發(fā)現(xiàn)，mtDNA缺失達50%時，呼吸功能仍不會受到影響。而HBV本身已經(jīng)損傷了線粒體功能，也就是說，HBV的作用可導致mtDNA大量減少。

在核苷類似物治療AIDS患者的研究中發(fā)現(xiàn)，短時間用藥可以改善PBMCs中mtDNA含量，長時間用藥會導致mtDNA數(shù)量下降[18，19]，這與本研究結果有所不同。本實驗阿德福韋酯用量為10mg/d，服藥達3年時或許尚未達到毒性濃度，且線粒體的損傷存在閾值效應。因此，尚不能確定更長時間用藥對線粒體的損傷情況，需要進一步觀察。

本研究發(fā)現(xiàn)，服藥2年時，患者血F2-isoprostanes較對照組顯著降低。F2-isoprostanes是自由基催化生物膜上的花生四烯酸發(fā)生脂質過氧化（非酶促反應）后的特異性產(chǎn)物，不受飲食的影響，能靈敏準確地反映體內(nèi)氧化應激水平，并與疾病的嚴重程度相關，是評估脂質過氧化最可靠的生化指標[20]。我們推測，HBV導致的線粒體損傷遠大于阿德福韋酯對線粒體復制的抑制。加之，只有當線粒體減少達一定比例時，才會導致其功能的異常[17]。

機體有酶類和非酶類兩大抗氧化防御體系，各抗氧化劑之間既有協(xié)同作用又有相互依賴和保護作用。TAOC代表機體實際抗氧化能力的總和，能比單一抗氧化劑提供更準確的信息[21]。MDA是氧自由基與生物膜上的多不飽和脂肪酸發(fā)生脂質過氧化的最終產(chǎn)物，但不是特異性產(chǎn)物。MDA可與DNA和蛋白等生物大分子相互作用，破壞其功能。MDA也可損害線粒體，其對線粒體的作用是呈劑量依賴性的。MDA可以通過抑制線粒體呼吸鏈和一些酶的活性引起線粒體功能紊亂[22]。本研究結果顯示，3組間MDA含量差異無統(tǒng)計學意義。F2-isoprostanes較MDA更容易從尿液排出[23]。因此，后者更能及早準確地反應體內(nèi)抗氧化能力的變化。

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