大鼠創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙模型及腹腔注射干預(yù)的影響

秦 雯，曲 睿，汪萌芽

(皖南醫(yī)學(xué)院 細(xì)胞電生理研究室，安徽 蕪湖 241002)

創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙(post-traumatic stress disorder，PTSD)是指個體由于遭受到對生命具有威脅的事件或嚴(yán)重創(chuàng)傷，導(dǎo)致癥狀長期持續(xù)的精神障礙。其主要的特征性癥狀包括對創(chuàng)傷的反復(fù)性體驗、持久性回避和警覺性增高［1－2］。與創(chuàng)傷記憶相關(guān)聯(lián)的癥狀即條件性恐懼，據(jù)此可以建立PTSD動物模型，即通過給予動物嚴(yán)重的創(chuàng)傷應(yīng)激，測試動物行為和生理的變化，以變化呈現(xiàn)應(yīng)激強度(劑量)依賴性，并可持續(xù)較長時間或隨時間逐漸增強為特征［3－5］。目前研究最多的是與創(chuàng)傷記憶相聯(lián)系的聯(lián)想性學(xué)習(xí)的恐懼性條件反射(fear conditioning)，表現(xiàn)為病理性重現(xiàn)、回避和對創(chuàng)傷線索的高度警覺反應(yīng)等癥狀，即為條件性恐懼記憶的PTSD模型［4－8］。為此，本文通過恐懼性刺激形成條件性恐懼記憶的方法制備大鼠PTSD干預(yù)的影響，特別已有研究顯示不同的給藥途徑如灌胃或腹腔注射(ip)均會對實驗動物的自主活動產(chǎn)生影響［9］，特通過腹腔注射這一干預(yù)措施，觀察其對模型大鼠條件性恐懼記憶的影響，為進(jìn)一步研究PTSD的恐懼記憶機制和干預(yù)治療奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1．1 動物雄性SD大鼠38只，由南京青龍山動物中心提供，體質(zhì)量(137．1±21．5)g。實驗前，大鼠先適應(yīng)性飼養(yǎng)一周，晝夜周期為12 h/12 h(8∶00開燈，20∶00熄燈)，室溫控制在(22±3)℃，每籠4只，自由進(jìn)食飲水。適應(yīng)期間，實驗者每天撫摸大鼠5 min左右，使其適應(yīng)實驗者操作。

1．2 儀器設(shè)備美國San Diego公司的Freeze Monitor System(恐懼監(jiān)測系統(tǒng))，包括3個測試箱，可提供光、聲及足底電刺激，以及恐懼反應(yīng)(木僵反應(yīng))檢測，均通過Freeze Monitor軟件由計算機自動控制完成。Morris水迷宮系統(tǒng)由自制的圓形不銹鋼水池、Smart視頻追蹤系統(tǒng)的紅外攝像頭，以及大鼠行為Morris實驗軟件(中科院心理健康重點實驗室隋南實驗室饋贈)組成，其游泳軌跡記錄和參數(shù)分析均由計算機自動完成。

1．3 PTSD模型制備與木僵時間檢測 參考文獻(xiàn)［4］并根據(jù)預(yù)試情況作刺激參數(shù)的適當(dāng)調(diào)整，制備PTSD模型。第1、2天:大鼠置于測試箱中，適應(yīng)2 min，每天檢測基礎(chǔ)木僵時間(即檢測大鼠同時阻斷三條紅外射線以前木僵狀態(tài)持續(xù)的時間)［10］。第3～5天上午:大鼠分別置于3個測試箱，適應(yīng)2 min后開始“聲音-電擊”配對刺激。20 min/d，先給予15 s聲音信號刺激，最后的10 s施加足底電擊(3 mA)，重復(fù)20次，間隔隨機。以此建立聲音與電刺激的配對條件性恐懼反應(yīng)(PTSD造模)。造模完成24 h后進(jìn)行條件性恐懼監(jiān)測，監(jiān)測指標(biāo)為木僵時間，以木僵時間百分比表示(即累計木僵時間占總監(jiān)測時間的百分比)。檢測日共檢測30次，每次持續(xù)監(jiān)測10 s，總監(jiān)測時間5 min。以木僵時間百分比達(dá)50%以上，為鑒定大鼠PTSD模型的標(biāo)準(zhǔn)。

1．4 動物分組和腹腔注射干預(yù) 將造模后大鼠按其木僵時間百分比分層隨機抽取14只，均分為2組:對照組和生理鹽水組。生理鹽水組于建模后行生理鹽水腹腔注射(ip，4 ml/kg，qd)，連續(xù)2周，觀察其對條件性恐懼反應(yīng)的影響。對照組不做任何處理。兩組模型大鼠均在生理鹽水組干預(yù)后第2、4、8、15天進(jìn)行木僵時間檢測，監(jiān)測時間5 min，10 s/次，以觀察條件性恐懼記憶的消退情況。

1．5 Morris水迷宮空間學(xué)習(xí)記憶能力測試［11－12］

1．5．1 尋找平臺訓(xùn)練方法 大鼠在進(jìn)行正式測試前，先進(jìn)行游泳以及尋找可視平臺的訓(xùn)練。訓(xùn)練時，將不銹鋼可視平臺置于迷宮水池的中心，臺面高出水面1 cm，每只大鼠先置于平臺上適應(yīng)20 s，隨后訓(xùn)練3次，隨機從不同象限的入水點投入水中，學(xué)習(xí)尋找平臺60 s，若超過60 s仍未找到平臺，由實驗者引導(dǎo)至平臺上停留15 s，然后取出。

1．5．2 定位航行實驗 為期7 d，將透明平臺置于4個象限中任一象限1/2弧度，池壁到池中心距離1/2的位置，水面高于臺面1 cm。每天測試1次，含分別從4個象限(順序隨機)面向池壁入水的4個測試，每個測試間隔30 s。大鼠在水中游泳的時間記為逃避潛伏期;若大鼠60 s內(nèi)未找到平臺，則由實驗者引導(dǎo)其登上平臺并停留15 s，此時的逃避潛伏期計為60 s。

1． 5空間探索實驗第7天定位航行實驗結(jié)束1 h后，將平臺撤離，大鼠從原平臺所在象限的對側(cè)象限入水，測試空間探索實驗1次。分析記錄大鼠在60 s內(nèi)穿過原平臺所在位置的次數(shù)。

1．6 統(tǒng)計學(xué)分析結(jié)果以ˉx±s表示。用配對t檢驗比較處理前后的差異，用單因素方差分析(oneway ANOVA)分析模型大鼠條件性恐懼記憶的消退情況，用重復(fù)測量的雙因素方差分析(two-way ANOVA)比較腹腔注射干預(yù)和對照組間條件性恐懼記憶的消退情況。

2 結(jié)果

2．1 聲音-電擊配對刺激對大鼠木僵時間百分比的影響38只大鼠經(jīng)過連續(xù)3 d的聲音-電擊配對刺激后，木僵時間百分比由刺激前的(18．63±9．76)%增加到(59．01 ±20．44)%(配對 t檢驗，P＜0．01，圖1A)，其中有28只大鼠的木僵時間百分比≥50%，達(dá)到條件性恐懼記憶的PTSD模型的鑒定標(biāo)準(zhǔn)(成功率為73．7%)。

2．2 木僵時間百分比與體質(zhì)量的相關(guān)性分析經(jīng)直線相關(guān)分析顯示，38只大鼠聲音-電擊配對刺激作用的效果(木僵時間百分比)與體質(zhì)量成一定的正相關(guān)關(guān)系(r=0．4200，P ＜0．01，圖 1B)。

圖1 聲音-電擊配對刺激對大鼠木僵時間百分比的影響

2．3 腹腔注射干預(yù)對模型大鼠體質(zhì)量的影響分析木僵反應(yīng)檢測日2組模型大鼠體質(zhì)量數(shù)據(jù)，重復(fù)測量雙因素 ANOVA顯示，測試間 F(4，48)=589．0，P ＜0．01;處理間 F(1，12)＜1，P ＞0．05。提示兩組大鼠的體質(zhì)量均呈現(xiàn)增長，但兩組間差異沒有顯著性意義。

圖2 腹腔注射(ip)干預(yù)對模型大鼠體質(zhì)量的影響

2．4 腹腔注射干預(yù)對模型大鼠木僵反應(yīng)的影響對模型制作后大鼠進(jìn)行5次測試的木僵時間百分比數(shù)據(jù)(圖3)，兩組分別進(jìn)行單因素ANOVA分析，結(jié)果對照組的測試次間 F(4，30)=2．25，P ＞0．05，提示模型動物恐懼記憶的消退無顯著性意義，PTSD模型有一定穩(wěn)定性;而生理鹽水組的測試次間F(4，30)=14．67，P ＜0．01，表明該組模型動物恐懼記憶有明顯的消退。對干預(yù)后的4次測試木僵時間百分比數(shù)據(jù)進(jìn)行重復(fù)測量雙因素ANOVA分析顯示，測試次間 F(3，36)=7．09，P ＜ 0．01，處理組間 F(1，12)=4．83，P ＜0．05，提示 ip 生理鹽水干預(yù)具有促進(jìn)模型動物恐懼記憶消退的作用。

圖3 腹腔注射干預(yù)對模型大鼠木僵時間百分比的影響

2．5 腹腔注射干預(yù)對模型大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力的影響2組大鼠Morris水迷宮測試的數(shù)據(jù)中，第1～7天各組定位航行實驗的逃避潛伏期數(shù)據(jù)見圖4A，其重復(fù)測量雙因素ANOVA顯示，測試日間F(6，72)=11．46，P ＜0．01，處理組間 F(1，12)＜1，P＞0．05，提示2組大鼠的Morris水迷宮空間學(xué)習(xí)能力差異無顯著性意義?？臻g探索實驗中，2組大鼠的穿臺次數(shù)(圖4B)，兩組 t檢驗:P＞0．05，結(jié)果提示2組大鼠Morris水迷宮空間記憶能力差異無顯著性意義。

圖4 腹腔注射干預(yù)對模型大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力的影響

3 討論

制備重復(fù)性和穩(wěn)定程度均較好的PTSD動物模型，是開展PTSD相關(guān)動物研究的基礎(chǔ)，也是本文旨在探討的首要問題。關(guān)于動物PTSD模型，盡管種類很多，仍沒有能代表PTSD全部核心癥狀、理想的動物模型［13］。與創(chuàng)傷記憶相聯(lián)結(jié)的條件性恐懼是PTSD最典型的癥狀之一，也是PTSD治療的重點與難點，故通過電刺激形成條件性恐懼記憶是最常用的 PTSD 模型之一［3，6，13］。制備 PTSD 動物模型，特別是形成條件性恐懼記憶的模型，首先要考慮刺激的強度，應(yīng)以能引起動物明確的恐懼反應(yīng)又不對動物造成軀體傷害為目標(biāo)。本文參考文獻(xiàn)報道的刺激強度［4］，并在預(yù)試過程中，反復(fù)根據(jù)不同年齡的大鼠進(jìn)行電擊強度的觀察和相應(yīng)調(diào)整，確定3 mA為有效的非條件刺激，能夠較好地建立聲音的條件刺激與足底電擊的非條件刺激的聯(lián)接。其次要考慮條件性恐懼的檢測指標(biāo)，應(yīng)盡量避免檢測操作的干擾和人為的主觀影響。本文一方面采用計算機自動控制、紅外監(jiān)測、與環(huán)境隔音的恐懼監(jiān)控系統(tǒng)檢測大鼠的木僵反應(yīng)，并采用木僵時間百分比作為觀察指標(biāo)。與造模前的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)進(jìn)行對比，盡管不同動物的效果不一，甚至有的動物在造模處理后木僵時間百分比可以降低，但總體比較造模處理后木僵時間百分比明顯升高，通過造模前后木僵時間百分比數(shù)據(jù)的分布情況，設(shè)定了木僵時間百分比≥50%為造模成功標(biāo)準(zhǔn)，其成功率為73．7%。最后更要考慮模型的穩(wěn)定性，形成的條件性恐懼記憶至少要有較慢的消退速度，才能進(jìn)行后續(xù)干預(yù)或治療的試驗。本文通過從造模處理后24 h到第15 d的觀察(對照組)，5次木僵時間百分比檢測結(jié)果顯示差異沒有顯著性意義，表明條件性恐懼記憶具有比較穩(wěn)定的特性，為以后進(jìn)行干預(yù)或治療的研究提供了可靠的模型基礎(chǔ)。

條件性恐懼記憶的PTSD模型是以經(jīng)典的巴甫洛夫條件反射為基礎(chǔ)的［6］，條件性恐懼記憶是情緒性記憶的一種，情緒性記憶由杏仁核為中心的多個腦區(qū)共同作用產(chǎn)生［14］。經(jīng)典巴甫洛夫條件反射性恐懼的中樞神經(jīng)環(huán)路是以杏仁核為中心，島葉、海馬、邊緣皮層以及小腦共同參與形成的［6，15］。條件性恐懼記憶的消退機制與內(nèi)側(cè)前額葉皮層(mPFC)，尤其是腹內(nèi)側(cè)前額葉皮層(vmPFC)的功能激活密切相關(guān)［16］。已有研究顯示vmPFC活動增強有助于條件性恐懼記憶的消退，參與消退記憶的鞏固、保持與表達(dá)［5，8］。

PTSD的臨床治療目前主要有心理治療和藥物治療兩個方面。心理治療主要是認(rèn)知暴露療法、心理疏導(dǎo)、行為治療等［17］。藥物治療主要是用抗抑郁藥(首選藥是5-羥色胺再攝取抑制劑)減少多巴胺釋放，使用抗驚厥藥提升氨基丁酸(GABA)的功能，用抗焦慮藥(如苯二氮艸卓類藥物)改善GABA的功能從而調(diào)節(jié)多巴胺等遞質(zhì)釋放［17－18］。由此可見，無論是在PTSD的機制研究，還是在PTSD的干預(yù)和治療研究中，用藥是經(jīng)常需要采用的方法之一。鑒于用藥等操作過程不僅對患者有安慰劑效應(yīng)，即使在動物試驗中也是一種刺激甚至是應(yīng)激因子，對PTSD模型的影響也是進(jìn)一步研究需要注意的問題。本實驗采用腹腔注射這一模擬藥物治療中常采用的動物試驗操作措施，來觀察其對條件性恐懼記憶的影響。結(jié)果顯示腹腔注射生理鹽水干預(yù)即具有影響恐懼記憶消退的作用。盡管不能因此而認(rèn)為生理鹽水具有促進(jìn)恐懼記憶消退的作用，但腹腔注射作為一種刺激或應(yīng)激，對模型大鼠恐懼記憶有促進(jìn)消退作用的可能性，不僅要求在類似的動物模型研究中必須考慮類似或相關(guān)因素的影響，嚴(yán)格對照實驗設(shè)計，同時也提示類似的干預(yù)措施有可能會與相關(guān)治療或干預(yù)方法產(chǎn)生相互影響。至于腹腔注射干預(yù)的作用機制，可能是由于阻斷了恐懼記憶的再鞏固。已有研究表明，恐懼記憶在提取時會出現(xiàn)消退和再鞏固兩種機制。消除恐懼記憶的方法可歸結(jié)為增強恐懼記憶的消退以及抑制恐懼記憶的再鞏固［7，19］，這樣在記憶被重新提取的再鞏固的同時，施以行為或藥物的干預(yù)措施，可能有助于消退恐懼記憶。

(致謝:王邦安高級實驗師提供部分技術(shù)協(xié)助。)

［1］ 王玉龍，謝偉，楊智輝，等．PTSD在中國的研究進(jìn)展［J］．應(yīng)用心理學(xué)，2005，11(2):176 －180．

［2］ 張婭玲，白艷秋，彭正午，等．創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙(PTSD)的生物學(xué)研究概述［J］．現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2011，11(1):172 －175．

［3］ COHEN H，KOZLOVSKY N，ALONA C，et al．Animal model for PTSD:From clinical concept to translational research［J］．Neuropharmacology，2012，62(2):715 －724．

［4］ 王禾，廖維宏，吳寶明，等．創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙大鼠動物模型行為學(xué)表現(xiàn)及學(xué)習(xí)記憶功能的變化［J］．中國臨床康復(fù)，2004，3(10):1848－1850．

［5］ 安獻(xiàn)麗，王文忠，鄭希耕．阻礙條件性恐懼記憶消退的原因分析［J］．心理科學(xué)進(jìn)展，2009，17(1):126 －131．

［6］ JOHNSON LR，MCGUIRE J，LAZARUS R，et al．Pavlovian fear memory circuits and phenotype models of PTSD［J］．Neuropharmacology，2012，62(2):638 －646．

［7］ 王紅波，安獻(xiàn)麗，李幼紅，等．干預(yù)條件性恐懼記憶表達(dá)的相關(guān)影響因素分析［J］．心理科學(xué)進(jìn)展，2010，18(5):718 －724．

［8］ QUIRK GJ，GARCIA R，LIMA FG．Prefrontal mechanisms in extinction of conditioned fear［J］．Biol Psychiatry，2006，60(4):337－343．

［9］ 劉天雅，洪宗元．灌胃與腹腔注射對小鼠自主活動的影響［J］．皖南醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2010，29(4):421 －423．

［10］ JIN XC，MA CL，LI BM．The α2A-adrenoceptor agonist guanfacine improves spatial learning but not fear conditioning in rats［J］．Acta Physiol Sin，2007，59(6):739 －744．

［11］ VORHEESCV，WILLIAMSMT．Morris water maze:procedures for assessing spatial and related forms of learning and memory［J］．Nature Protocols，2006，1(2):848 －858．

［12］秦雯，曲睿，汪萌芽．大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力測試的時反應(yīng)量-效關(guān)系［J］．皖南醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2010，29(6):462 －465．

［13］劉媛，王莉，伍亞民．創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙的實驗動物模型［J］．中國臨床神經(jīng)科學(xué)，2010，18(4):436 －439．

［14］唐向陽，汪凱，程懷東．情緒記憶的神經(jīng)機制［J］．臨床神經(jīng)病學(xué)雜志，2008，21(5):399 －400．

［15］ KIM JJ，JUNG MW．Neural circuits and mechanisms involved in pavlovian fear conditioning:a critical review［J］．Neurosci Biobehav Rev，2006，30(2):188 －202．

［16］ PETERSJ，KALIVAS PW，QUIRK GJ．Extinction circuits for fear and addiction overlap prefrontal cortex［J］．Learn Mem，2009，16(5):279－288．

［17］張?zhí)?，傅安球．?chuàng)傷后應(yīng)激障礙的生物學(xué)影響因素及相關(guān)藥物治療的研究進(jìn)展［J］．東南大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版)，2011，30(4):649－652．

［18］ DAVIS M，MYERS KM，CHHATWAL J，et al．Pharmacological treatments that facilitate extinction of fear:relevance to psychotherapy［J］．NeuroRx，2006，3(1):82 －96．

［19］ SCHILLER D，MONFILSMH，RAIO CM，et al．Preventing the return of fear in humans using reconsolidation update mechanisms［J］．Nature，2010，463(7277):49 －53．