濃縮方法及保存條件對小球藻藻膏脂肪酸的影響

陳煒，王秀芬，白永安，李曉東，邢殿樓

(1.大連海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，遼寧大連116023;2.盤錦光合水產(chǎn)有限公司，遼寧盤錦124200;3.大連海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點實驗室，遼寧大連116023)

小球藻Chlorella sp.是水產(chǎn)經(jīng)濟動物幼體的優(yōu)質(zhì)天然餌料。在實際生產(chǎn)中，因天氣、季節(jié)等因素的影響，常常使得小球藻培養(yǎng)量不穩(wěn)定，導(dǎo)致育苗中鮮藻液供給不足，因此，需要儲備一定量的濃縮藻液或藻膏，以備鮮藻液缺乏時使用。

小球藻在濃縮和保存過程中，其營養(yǎng)成分的變化情況是一個值得關(guān)注的問題。小球藻的營養(yǎng)價值主要與其多不飽和脂肪酸 (PUFA)有關(guān)。目前，濃縮單胞藻的方法主要有物理濃縮法和化學(xué)濃縮法，研究多集中于濃縮效果及保存條件對單胞藻存活的影響方面［1-5］，而關(guān)于濃縮方法及保存條件對單胞藻脂肪和脂肪酸的影響方面，僅見王培磊等［6］、朱葆 華 等［7］、Montaini 等［8］、Grima 等［9］、宮慶禮等［10］分別對球等鞭金藻 Isochrysis galbana、扁藻Tetraselmis suecica、小球藻和綠色巴夫藻Pavlova viridis的濃縮藻液進行過少量報道。為此，作者詳細研究了不同濃縮方法對小球藻粗脂肪和脂肪酸組成以及保存溫度、時間對小球藻脂肪酸含量的影響，以期為小球藻濃縮方式、保存條件、貯存時間等的確定提供參考資料。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗用蛋白核小球藻Chlorella pyrenoidesa取自盤錦光合水產(chǎn)有限公司三角洲養(yǎng)殖場。

1.2 方法

1.2.1 小球藻的培養(yǎng) 將蛋白核小球藻在室外敞池培養(yǎng)，接種后及加水?dāng)U種后施用無機肥 (w(碳酸氫銨)∶w(過磷酸鈣)=2∶1)，全池均勻潑灑。適時進水和施肥。取樣前兩天每天施肥一次，保證試驗池中營養(yǎng)充足。每天監(jiān)測試驗池的藻細胞密度和水化學(xué)指標。培養(yǎng)期間主要水化學(xué)指標:水溫為10.0～12.5℃，鹽度為19～21，pH為8.55～9.33，溶解氧為 15.2～20.0 mg/L，氨態(tài)氮為24.29～70.95 mg/L，活性磷為0.71～2.37 mg/L，透明度為11～18 cm。

1.2.2 濃縮方法

1)離心法 抽取新鮮藻液，經(jīng)GF-105型管式高速分離機 (16 000 r/min)離心得到濃縮藻膏(簡稱離心組)。重復(fù)3次。

2)絮凝法 分別采用明礬、殼聚糖/海藻酸鈉混合溶液進行絮凝試驗。試驗容器體積為50 L塑料桶。每種絮凝方式設(shè)3個重復(fù)組。根據(jù)文獻［1-2，5-6］和預(yù)試驗結(jié)果確定絮凝劑的使用量和配比，根據(jù)投入絮凝劑后藻液中的細胞密度(分光光度法)確定取樣時間。

明礬絮凝濃縮組 (簡稱明礬組) 按80 mg/L的濃度向藻液中添加明礬母液，充分攪勻，靜置12 h。采用虹吸法除去上清液，收集絮凝沉積的樣品。

殼聚糖/海藻酸鈉混合溶液絮凝濃縮組 (簡稱殼/海組) 按6 mg/L的總濃度向藻液中先添加殼聚糖母液 (含體積分數(shù)為5%的醋酸溶液)，攪勻后再添加海藻酸鈉母液，按同一方向攪勻，使w(殼聚糖)∶w(海藻酸鈉)=9∶1。靜置12 h后去除上清液，收集絮凝沉積的樣品。

1.2.3 保存方法 將離心得到的新鮮藻膏用小瓶(3～5 g/瓶)盛裝后分成3組，每組為10瓶，分別置于常溫 (14.5～18.5℃)、冷藏 (4℃)和冷凍 (-24℃)條件下保存。常溫組于試驗開始后的第1、2、3周取樣測定;冷藏組于試驗開始后第2、8周取樣測定，直至觀察到樣品酸敗腐臭時終止試驗;冷凍組于試驗開始后的半年、1年取樣測定，當(dāng)樣品脂肪酸明顯氧化時終止試驗。每次取2瓶進行分析，每瓶重復(fù)測定兩次。

1.2.4 脂肪酸的測定方法和色譜條件 依改進的Folch法［11］提取粗脂肪。將所得粗脂肪用 KOH-甲醇于70℃下皂化1 h后，采用BF3催化法［12］制備脂肪酸甲酯，最后轉(zhuǎn)移濃縮到石油醚中供色譜分析。

用日本島津GC-2010型氣相色譜儀進行脂肪酸分析。色譜條件:色譜柱為FFAP抗氧化交聯(lián)石英毛細管柱 (中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所生產(chǎn))，規(guī)格為30 m×0.25 mm×0.3 μm;進樣口溫度為260℃，分流比為100∶1;高純N2為載氣，柱流量為1 mL/min，柱溫由160℃以2℃/min的速度升至230℃，并保持至出峰完畢;FID檢測器，溫度為230℃。色譜峰的鑒定采用部分脂肪酸甲酯標準樣品 (SIGMA公司和上海試劑一廠生產(chǎn))與ECL值相結(jié)合的方法［13-15］，采用面積歸一化法進行定量分析。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析，試驗數(shù)據(jù)用平均值±標準差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃縮方法制得的小球藻藻膏中粗脂肪和脂肪酸的含量

采用3種濃縮方式制得的藻膏中，離心組、殼/海組和明礬組粗脂肪的質(zhì)量分數(shù)(干物質(zhì))分別為(23.38±0.99)%、(14.12±0.38)%、(4.17±0.11)%，且3組的粗脂肪含量之間均存在顯著差異 (P＜0.05)。

從表1可見，用不同濃縮方式得到的小球藻藻膏中脂肪酸的種類一致，質(zhì)量分數(shù)超過10%的脂肪酸均為16∶0、16∶1、20∶5n-3。但離心組與絮凝組藻膏之間的脂肪酸含量存在一定差異，離心組與殼/海組之間有5種脂肪酸含量差異顯著 (P＜0.05)，與明礬組之間有8種脂肪酸含量差異顯著(P＜0.05)。明礬組多不飽和脂肪酸的含量僅為離心組的76%，這主要是由于20∶5n-3(EPA)的含量顯著降低所致;而飽和脂肪酸卻比離心組增加了56%，主要是由于16∶0的含量增加所致。

2.2 不同保存條件下小球藻藻膏的脂肪酸含量

常溫 (14.5～18.5℃)下保存的小球藻藻膏中脂肪酸的含量見表2。從表2可見，小球藻藻膏在常溫下保存3周期間，除18∶3n-6和20∶3n-6的含量有所波動之外，其余脂肪酸的含量均無顯著變化。但在試驗期間，藻膏的顏色、氣味等外觀特征變化非常大:當(dāng)保存一周后，藻膏逐漸產(chǎn)生異樣腥味，并隨著保存時間的延長，腥臭味漸濃;保存4周時，藻膏由綠色變?yōu)槟谏?，膏體變稀，產(chǎn)生刺鼻的腐臭氣味，已經(jīng)明顯腐敗，故試驗終止。

冷藏 (4℃)條件下保存的小球藻藻膏中脂肪酸的含量見表3。從表3可見，在冷藏8周期間，脂肪酸種類沒有變化，幾乎所有脂肪酸 (除14:1外)的含量均無顯著變化。此外，在冷藏條件下保存6周時，藻膏開始產(chǎn)生異樣腥味，至8周時腥臭氣味漸濃，腐敗跡象明顯。

在冷凍 (-24℃)條件下保存的小球藻藻膏中脂肪酸的含量見表4。從表4可見，藻膏在冷凍條件下保存1年期間脂肪酸種類保持不變，與此同時，各脂肪酸相對含量隨著冷凍時間的延長而逐漸發(fā)生變化。在冷凍條件下保存半年時，除14:1和18:1n-9之外，各脂肪酸含量與新鮮藻膏之間的差異并不顯著;保存至一年時，多不飽和脂肪酸含量由占總脂肪酸含量的50.87%明顯減少至47.84%(主要是由于20:5n-3的減少所致)，單不飽和脂肪酸含量則由初始時占總脂肪酸含量的27.54%明顯增加至30.20%。

表1 不同濃縮方式下小球藻脂肪酸的含量Tab.1 Content of fatty acids in Chlorella pyrenoidesa concentrated by different methods w/%

表2 常溫下保存的小球藻藻膏中脂肪酸的含量Tab.2 Content of fatty acids in Chlorella pyrenoidesa paste stored at room temperature w/%

表3 4℃下保存的小球藻藻膏中脂肪酸的含量Tab.3 Content of fatty acids in Chlorella pyrenoidesa paste stored at 4℃ w/%

表4 -24℃下保存的小球藻藻膏中脂肪酸的含量Tab.4 Content of fatty acids in Chlorella pyrenoidesa paste stored at-24℃ w/%

綜上所述，小球藻在保存過程中，脂肪酸的種類保持不變，各脂肪酸的含量因保存溫度和保存時間而異。藻膏分別在常溫 (14.5～18.5℃)下保存3周、4℃下保存8周、-24℃下保存半年時，大部分脂肪酸的含量無明顯變化;但在-24℃下保存至1年時，20:5n-3和PUFA的百分含量顯著減少 (P＜0.05)。因此，藻膏在14.5～18.5℃下保存不宜超過1周，冷藏 (4℃)下不宜超過6周，冷凍下 (-24℃)不宜超過半年。

3 討論

3.1 不同濃縮方法對小球藻粗脂肪和脂肪酸含量的影響

本試驗中，離心組藻膏的粗脂肪含量明顯高于兩組絮凝組。這是由于通過絮凝方式得到的藻膏中的絮凝劑無法與藻體分離，使絮凝劑在樣品中占有一定的比例，導(dǎo)致絮凝組藻膏的粗脂肪相對含量偏低。絮凝劑使用量越大，則粗脂肪相對含量越低。

宮慶禮等［10］采用超濾技術(shù)濃縮小球藻的研究表明，濃縮前后小球藻的總脂肪含量和脂肪酸成分均未見顯著變化。在本試驗的3種濃縮方法中，離心濃縮方式效果最好，濃縮效率高，不存在絮凝劑殘留問題，但成本較高;殼聚糖和海藻酸鈉作為絮凝劑，安全性高，濃縮效果尚可，脂肪酸含量與離心組比較接近;采用明礬濃縮方式的生產(chǎn)成本最低，但藻膏中的不飽和脂肪酸 (尤其是EPA)含量顯著下降。此外，在試驗中還觀察到，明礬組藻液顏色發(fā)黃，沉淀的小球藻分散性差，細胞變性，說明明礬對小球藻的毒害作用較大。這與孫建華等［1］的研究結(jié)果一致。

綜上所述，絮凝方式不僅使藻膏粗脂肪明顯降低，而且使部分脂肪酸含量改變，其中明礬組的多不飽和脂肪酸含量比離心組減少約24%，表明采用明礬絮凝方式降低了小球藻的營養(yǎng)價值。

3.2 保存條件對小球藻藻膏脂肪酸含量的影響

在常溫下，藻細胞代謝旺盛，加之藻密度極大(泥膏狀)，藻細胞死亡后酸敗，產(chǎn)生一些胺類、脂肪聚合物、醛、酮、過氧化氫和烴類等物質(zhì)，發(fā)出一種刺鼻的腥臭氣味。王培磊等［6］在試驗中亦觀察到相同的現(xiàn)象。

不同學(xué)者在藻濃縮液冷藏保存過程中得到的脂肪酸變化規(guī)律的研究結(jié)果也不盡相同。Grima等［9］研究了冷藏 (4℃下保存30 d)條件下對球等鞭金藻濃縮液活性和脂肪酸分布的影響，發(fā)現(xiàn)雖然脂肪酸分布不受存貯時間的影響，多不飽和脂肪酸幾乎保持不變，但飽和脂肪酸和單不飽和脂肪酸卻有明顯降低。朱葆華等［7］在研究溫度對綠色巴夫藻和球等鞭金藻保存效果的影響時發(fā)現(xiàn)，4℃下保存45 d時，球等鞭金藻中飽和脂肪酸的含量明顯降低，而不飽和脂肪酸含量基本保持不變;綠色巴夫藻中飽和脂肪酸的含量先降低再略升，不飽和脂肪酸亦基本保持不變。Montaini等［8］將扁藻濃縮液于4℃下保存90 d后發(fā)現(xiàn)其脂肪酸組成沒有變化。王培磊等［6］將小球藻和球等鞭金藻濃縮液于0～4℃下保存5個月后，觀察到其脂肪酸無顯著變化。由此可見，不同研究者得出的“脂肪酸的分布和種類不隨保存條件和時間的變化而變化”的結(jié)論是一致的，而在脂肪酸含量的變化規(guī)律上存在差異。這可能與藻的種類、濃縮液密度、保存條件以及取樣截取時間點等不同有關(guān)。

小球藻藻膏在冷凍保存1年期間脂肪酸種類不變，這與Montaini等［8］對扁藻 (-18℃下保存21個月)以及Grima等［9］對金藻 (-20℃下保存30 d)的研究結(jié)果一致。不同類型脂肪酸被氧化的速率不同，當(dāng)某種脂肪酸被氧化速率比總脂肪酸平均氧化速率快時，其在總脂肪酸中的相對含量將減小，反之則增大。本試驗中，當(dāng)藻膏在-24℃下冷凍保存1年時，PUFA由初始的50.87%減少至47.84%，MUFA由初始的27.54%增加至30.20%，說明PUFA被氧化的速率比總脂肪酸平均氧化速率快，而MUFA被氧化的速率比總脂肪酸平均氧化速率慢。朱葆華等［7］在對金藻和綠色巴夫藻的試驗中發(fā)現(xiàn)，綠色巴夫藻于-22℃下保存45 d時，SFA有所減少。本試驗中，SFA含量在冷凍保存半年時也略有減少，當(dāng)冷凍至1年時又稍有增加。這可能是由于SFA開始時被氧化的速率略高于總脂肪酸的平均氧化速率，而后又略低于總脂肪酸的平均氧化速率所致。

總之，藻膏在不同溫度下脂肪酸變化的內(nèi)在機制比較復(fù)雜，存活的藻細胞仍有一定的代謝能力，死亡細胞則逐漸腐敗。此外，隨著保存時間的延長，同時也存在脂肪酸被氧化的問題。因此，有必要通過脂肪酸含量的變化規(guī)律來進一步研究脂肪酸變化的內(nèi)在機理。

致謝:試驗過程中得到大連海洋大學(xué)雷衍之教授和李永函教授的悉心指導(dǎo)和熱情幫助，在此表示衷心感謝!

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