Cd(Ⅱ)脅迫對鹽藻生長、抗氧化系統(tǒng)及線粒體膜電位的影響

向蓓，趙文，王媛，田丹

(大連海洋大學(xué)遼寧省水生生物學(xué)重點實驗室，遼寧大連116023)

鎘 (Cd)是一種毒性很強的重金屬污染物，主要來源于冶煉、電鍍、蓄電池、采礦等工業(yè)排放的廢水中，對微生物、植物、動物和人體產(chǎn)生強烈的毒害作用。在Cd(Ⅱ)脅迫下，植物體發(fā)生生理應(yīng)激和防御反應(yīng)，如合成植物螯合肽 (phytochelatin)，以降低Cd(Ⅱ)對機(jī)體的傷害［1］。海洋微藻是海洋初級生產(chǎn)力的重要組成者，對水體環(huán)境的變化非常敏感，進(jìn)入水中的重金屬等污染物首先作用于藻類，通過食物鏈傳遞與富集作用而危害生物健康［2］。已有研究表明，Cd(Ⅱ)能影響藻類的生長代謝，抑制藻類的光合作用，脅迫藻體內(nèi)產(chǎn)生大量活性氧自由基，導(dǎo)致膜質(zhì)過氧化，也可誘導(dǎo)藻體內(nèi)超氧化物歧化酶、過氧化物酶等抗氧化酶活性的升高，在一定程度上清除活性氧自由基，降低細(xì)胞的受損程度［3-5］。

Kerr等［6］首次提出了細(xì)胞凋亡的概念，人們對細(xì)胞凋亡的研究也開始逐漸深入。細(xì)胞凋亡在形態(tài)學(xué)上主要表現(xiàn)為染色質(zhì)凝聚和片段化、細(xì)胞質(zhì)減少、核片段化、細(xì)胞膜發(fā)泡形成凋亡小體，死亡細(xì)胞很快被鄰近細(xì)胞吞噬而不留痕跡［7-8］。已有研究表明，Cd(Ⅱ)脅迫能引起煙草懸浮細(xì)胞凋亡，這可能是由Cd(Ⅱ)脅迫產(chǎn)生的活性氧物質(zhì) (ROS)所導(dǎo)致的［9］。衣藻能在UV-C脅迫后發(fā)生凋亡，并克隆得到凋亡基因dad1序列［10］。目前對細(xì)胞凋亡的研究多集中在多細(xì)胞的動物和植物，對單細(xì)胞藻類凋亡的研究還很少，且線粒體作為凋亡調(diào)控中心越來越受到人們的重視。鹽藻Dunaliella salina是一種獨特的單細(xì)胞綠藻，無細(xì)胞壁，耐鹽能力強，培養(yǎng)條件便利，是十分重要的藻類資源。為此，本試驗中，作者以鹽藻為材料，研究了不同濃度的Cd(Ⅱ)脅迫對鹽藻生長、抗氧化系統(tǒng)及線粒體膜電位的影響，旨在為進(jìn)一步探索重金屬脅迫對單細(xì)胞藻類的凋亡機(jī)理提供參考資料。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗所用鹽藻取自大連海洋大學(xué)遼寧省水生生物學(xué)重點實驗室。海水取自大連市黑石礁近岸海域，沉淀后經(jīng)0.45 μm篩網(wǎng)過濾，煮沸消毒，冷卻曝氣后配制培養(yǎng)液，培養(yǎng)液選用f/2營養(yǎng)鹽配方。

試驗所用重金屬鎘以CdCl2·2.5H2O形態(tài)加入。Rhodamine 123購自Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 Cd(Ⅱ)脅迫處理 試驗前，將三角錐瓶預(yù)先用高壓滅菌鍋在120℃下滅菌20 min。用培養(yǎng)液對鹽藻進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)，當(dāng)鹽藻密度達(dá)到1×106個/mL后，將其分裝到12個250 mL的三角錐瓶中，每瓶加入100 mL。向藻液中加入已配制好的Cd(Ⅱ)母液，使 Cd(Ⅱ)的終濃度分別為0、0.01、0.10、1.00 mmol/L，分別記為對照組和低、中、高濃度組，每組設(shè)3個重復(fù)。將三角錐瓶置于光照培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)7 d，溫度為 (25±1)℃，光照強度為2 500 lx，光暗周期為12 h∶12 h。

1.2.2 細(xì)胞密度的測定 用碘液固定藻液，用血球計數(shù)板計數(shù)，每瓶藻液取樣3次進(jìn)行計數(shù)。

試驗進(jìn)行到第7天，收集藻樣并對生理生化指標(biāo)進(jìn)行測定。

1.2.3 葉綠素a含量的測定 采用以丙酮為萃取液的分光光度法測定葉綠素a的含量［11］，用UV-6300 PC型分光光度計分別測定750、664、647、630 nm波長處的吸光值，并分別用波長664、647、630 nm下測得的吸光值減去750 nm下的吸光值，得到校正后的吸光值E664nm、E647nm、E630nm，按下式計算葉綠素a的含量ρ:

式中:V0為樣品提取液的體積 (mL);V為藻液樣品實際用量 (L);L為測定池光程 (cm)。

1.2.4 丙二醛、超氧化物歧化酶、總抗氧化力及可溶性蛋白含量的測定 將藻液濃縮40倍后，對收集的藻細(xì)胞在冰浴中超聲破碎5 min，4℃下以10 000 r/min離心10 min，保留上清液，待測。按照南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的試劑盒上注明的方法測定丙二醛 (MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、總抗氧化力活性及可溶性蛋白含量。

1.2.5 用流式細(xì)胞術(shù)檢測線粒體的膜電位 取1 mL藻液，加入5 μL Rhodamine 123(Rh 123，濃度為500 μg/mL)，室溫下孵育30 min，用海水洗兩遍，以去除液體中的Rh 123，用流式細(xì)胞儀測定其熒光強度。Rh 123的激發(fā)波長為488 nm，發(fā)射波長為530 nm。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 16.0統(tǒng)計分析軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，并用LSD法進(jìn)行多重比較。所有數(shù)據(jù)均用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差來表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 Cd(Ⅱ)脅迫對鹽藻生長的影響

從圖1可見:隨著時間的延長，各試驗組鹽藻細(xì)胞數(shù)均不斷增長，在低濃度 Cd(Ⅱ)(0.01 mmol/L)脅迫下，鹽藻生長與對照組無顯著差異(P＞0.05);當(dāng)Cd(Ⅱ)濃度為0.10 mmol/L時，前5 d與對照組差異不顯著，但后兩天細(xì)胞生長明顯受到抑制，與對照組有顯著差異 (P＜0.05);當(dāng)Cd(Ⅱ)濃度達(dá)到1.00 mmol/L時，鹽藻生長明顯低于對照組 (P＜0.05)，說明高濃度的Cd(Ⅱ)能抑制鹽藻的生長。

圖1 Cd(Ⅱ)脅迫對鹽藻生長的影響Fig.1 Effects of Cd(Ⅱ)stress on the growth of alga Dunaliella salina

2.2 Cd(Ⅱ)脅迫對鹽藻葉綠素a和可溶性蛋白含量的影響

從表1可見:低、中濃度Cd(Ⅱ)處理組鹽藻的葉綠素a含量分別比對照組極顯著增加4.57%、48.57%(P＜0.01)，而高濃度Cd(Ⅱ)組卻比對照組極顯著降低32.11%(P＜0.01);中濃度Cd(Ⅱ)處理組可溶性蛋白含量比對照組極顯著增加83.97%(P＜0.01)，而高濃度Cd(Ⅱ)組卻比對照降低4.85%，但差異不顯著 (P＞0.05)。

2.3 Cd(Ⅱ)脅迫對鹽藻SOD活性的影響

經(jīng)Cd(Ⅱ)處理7 d后，鹽藻超氧化物歧化酶活性的變化如圖2所示。從圖2可見:隨著Cd(Ⅱ)濃度的增大，鹽藻SOD活性顯著增強，中、高濃度Cd(Ⅱ)處理組SOD活性比對照組分別升高70.16%和21.89%，且差異極顯著 (P＜0.01);而低濃度Cd(Ⅱ)組與對照組差異不顯著 (P＞0.05)。

表1 Cd(Ⅱ)脅迫對鹽藻葉綠素a和可溶性蛋白含量的影響Tab.1 Effects of Cd(Ⅱ)stress on the concentration of Chl a and soluble protein in Dunaliella salina

圖2 Cd(Ⅱ)脅迫對鹽藻超氧化物歧化酶活性的影響Fig.2 Effects of Cd(Ⅱ)stress on SOD activities in alga Dunaliella salina

2.4 Cd(Ⅱ)脅迫對鹽藻丙二醛含量的影響

經(jīng)Cd(Ⅱ)處理7 d后，鹽藻中丙二醛含量的變化如圖3所示。從圖3可見:低、中、高濃度Cd(Ⅱ)處理組鹽藻中丙二醛含量分別比對照組升高61.98%、125.00%、35.94%，且差異極顯著(P＜0.01)，表明Cd(Ⅱ)能引起鹽藻細(xì)胞膜質(zhì)過氧化損傷。

2.5 Cd(Ⅱ)脅迫對鹽藻總抗氧化力的影響

經(jīng)Cd(Ⅱ)處理7 d后，鹽藻總抗氧化力的變化如圖4所示。從圖4可見:低濃度Cd(Ⅱ)處理組鹽藻總抗氧化力低于對照組，但差異不顯著 (P＞0.05);中濃度Cd(Ⅱ)處理組總抗氧化力極顯著高于對照組 (P＜0.01);高濃度Cd(Ⅱ)處理組的總抗氧化力與對照組無明顯差異 (P＞0.05)。

圖3 Cd(Ⅱ)脅迫對鹽藻丙二醛含量的影響Fig.3 Effects of Cd(Ⅱ)stress on concentration of MDA in alga Dunaliella salina

圖4 Cd(Ⅱ)脅迫對鹽藻總抗氧化力的影響Fig.4 Effects of Cd(Ⅱ)stress on total antioxidative capacity in alga Dunaliella salina

2.6 Cd(Ⅱ)脅迫對鹽藻線粒體膜電位的影響

經(jīng)Cd(Ⅱ)處理7 d后，鹽藻線粒體的膜電位變化如圖5所示。由圖5可見，經(jīng)Cd(Ⅱ)脅迫后鹽藻細(xì)胞線粒體膜電位有下降趨勢，但差異不顯著(P ＞0.05)。

3 討論

隨著Cd(Ⅱ)濃度的升高，鹽藻單位細(xì)胞內(nèi)葉綠素a和可溶性蛋白含量均呈現(xiàn)先升高再下降的趨勢。0.10 mmol/L的Cd(Ⅱ)處理組鹽藻葉綠素a含量顯著升高，可能是由于較低濃度的Cd(Ⅱ)在一定程度上刺激了藻體葉綠素的合成。而1.00 mmol/L的Cd(Ⅱ)處理組鹽藻葉綠素a含量急劇下降，其機(jī)理可能是:經(jīng)高濃度Cd(Ⅱ)脅迫后能引起葉綠體膨脹破裂，類囊體膜解體，從而導(dǎo)致葉綠素從組織中流失［5］;也可能是與Cd(Ⅱ)抑制葉綠素酸酯還原酶活性和影響氨基-γ-戊酮酸的合成有關(guān)，而這兩種物質(zhì)分別是葉綠素合成所必需的酶和前體［12］?？扇苄缘鞍缀渴侵参矬w代謝過程中的重要指標(biāo)，可反映細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的合成、變性及降解等信息［13］。本研究結(jié)果表明，0.10 mmol/L Cd(Ⅱ)處理組鹽藻可溶性蛋白含量比對照組顯著升高。這可能是較低濃度的Cd(Ⅱ)誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生一些抗性蛋白，如金屬硫蛋白等，而這些抗性蛋白能吸附重金屬離子，降低重金屬離子對生物體的毒害［14］。但當(dāng)Cd(Ⅱ)達(dá)到1.00 mmol/L時，可溶性蛋白含量下降，蛋白質(zhì)被破壞。這可能是Cd(Ⅱ)與蛋白相結(jié)合的直接作用，也可能是以DNA為靶點，限制基因表達(dá)，從而影響蛋白質(zhì)的合成［15］。

圖5 Cd(Ⅱ)脅迫對鹽藻線粒體膜電位的影響Fig.5 Effects of Cd(Ⅱ)stress on mitochondrial membrane potential in alga Dunaliella salina

丙二醛是多不飽和脂肪酸過氧化產(chǎn)物之一，其含量的變化可以反映膜氧化的損傷程度。丙二醛對細(xì)胞有毒性，能引起細(xì)胞膜功能紊亂，且對許多功能分子有破壞作用，因此，丙二醛含量的增加是細(xì)胞損傷的直接原因［16］。本試驗中丙二醛含量先隨Cd(Ⅱ)濃度的增大而升高，說明Cd(Ⅱ)濃度越大對細(xì)胞膜系統(tǒng)的損傷也越大。之后當(dāng)Cd(Ⅱ)濃度達(dá)到1.00 mmol/L時，丙二醛含量下降但仍高于對照組，可能是鹽藻受到不可逆損傷，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)代謝速率大幅度下降［17］。

細(xì)胞受到脅迫后會產(chǎn)生活性氧物質(zhì) (ROS)，如超氧根 (·)、氫氧根 (OH-)、羥自由基(·OH)、過氧化氫 (H2O2)等，這些活性氧物質(zhì)能破壞脂膜類物質(zhì)、蛋白質(zhì)以及核酸，而超氧化物歧化酶是生物體內(nèi)清除超氧陰離子自由基 (·)的唯一酶類［18-19］。本試驗中，在 Cd(Ⅱ)脅迫下，鹽藻超氧化物歧化酶活性均高于對照組，且隨著Cd(Ⅱ)濃度的升高呈上升趨勢，表明鹽藻對Cd(Ⅱ)的脅迫有一定的耐受性。這與田丹等［20］的研究結(jié)果不同，可能是因為鹽藻比普通小球藻和湛江等鞭金藻耐受Cd(Ⅱ)的能力更強。在本試驗中Cd(Ⅱ)的設(shè)定濃度范圍內(nèi)，鹽藻的超氧化物歧化酶活性可被誘導(dǎo)而升高。Cd(Ⅱ)進(jìn)入鹽藻細(xì)胞后會導(dǎo)致丙二醛的含量升高，而·與丙二醛含量變化具有相關(guān)性［17］，因此，細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生了較多的·，而·可誘導(dǎo)超氧化物歧化酶的活性，即超氧化物歧化酶清除·的能力增強，因而使·能得到及時清除，從而降低·對細(xì)胞的氧化損傷。

總抗氧化力是用于衡量機(jī)體氧化系統(tǒng)功能狀況的綜合性指標(biāo)，其變化可以反映機(jī)體抗氧化酶系統(tǒng)和非酶系統(tǒng)性能的狀態(tài)，從總體上反映機(jī)體防御體系抗氧化能力的高低［21］。本試驗結(jié)果表明，當(dāng)Cd(Ⅱ)達(dá)到0.10 mmol/L時，鹽藻的總抗氧化力增強。其原因可能是較低濃度的Cd(Ⅱ)誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生過多的活性氧物質(zhì)，進(jìn)而啟動細(xì)胞防御反應(yīng)，使得總抗氧化力暫時升高。當(dāng)Cd(Ⅱ)的濃度增大到1.00 mmol/L時，對一些抗氧化酶類產(chǎn)生抑制，從而使細(xì)胞的總抗氧化力降低。

近年來，線粒體作為細(xì)胞凋亡的調(diào)控中心越來越受到人們的重視。線粒體跨膜電下降被認(rèn)為是細(xì)胞凋亡的共同途徑。在正常情況下，機(jī)體內(nèi)活性氧的產(chǎn)生和清除系統(tǒng)處于一種動態(tài)平衡狀態(tài)，當(dāng)這種平衡被打破時，活性氧水平較高，線粒體通透性轉(zhuǎn)運孔開放，導(dǎo)致膜電位丟失，各種凋亡促進(jìn)因子釋放到胞質(zhì)中，激活caspase，誘導(dǎo)凋亡發(fā)生［22-24］。本試驗結(jié)果表明，隨著Cd(Ⅱ)濃度的增加，鹽藻細(xì)胞線粒體膜電位呈下降趨勢，但各處理組與對照組差異不顯著。這可能是因為本試驗中Cd(Ⅱ)的脅迫濃度較低，鹽藻對較低濃度的Cd(Ⅱ)表現(xiàn)不十分敏感。

綜上所述，一定濃度的Cd(Ⅱ)能抑制鹽藻的生長，抑制葉綠素 a及可溶性蛋白的合成;Cd(Ⅱ)進(jìn)入細(xì)胞后，使細(xì)胞產(chǎn)生過多的活性氧，導(dǎo)致膜氧化的損傷程度加重，丙二醛含量升高，而活性氧又能誘導(dǎo)超氧化物歧化酶活性升高，超氧化物歧化酶歧化·生成O2和H2O2，從而保護(hù)細(xì)胞不受到自由基的氧化損傷;細(xì)胞活性氧的水平升高，促進(jìn)了總抗氧化能力提高，從而降低活性氧對細(xì)胞的傷害，保護(hù)線粒體膜的完整性，維持線粒體膜電位，抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生。

［1］Tsuji N，Hirayanaqi N，Iwabe T，et al.Regulation of phytochelatin synthesis by zinc and cadmium in marine green alga，Dunaliella tertiolecta［J］.Phytochemistry，2003，62(3):453-459.

［2］王文雄，潘進(jìn)芬.重金屬在海洋食物鏈中的傳遞［J］.生態(tài)學(xué)報，2004，24(3):599-604.

［3］李春娣，馬?？?，龍愛民，等.Cd脅迫對受馴杜氏鹽藻生長影響的研究［J］.海洋環(huán)境科學(xué)，2007，26(6):557-560.

［4］Nishikawa K，Yamakoshi Y，Uemura I，et al.Ultrastructural changes in Chlamydomonas acidophila(Chlorophyta)induced by heavy metals and polyphosphate metabolism［J］.FEMS Microbiology E-cology，2003，44(2):253-259.

［5］徐勤松，施國新，杜開和，等.Cd(Ⅱ)處理對菹草葉片保護(hù)酶活性和細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的毒害影響［J］.水生生物學(xué)報，2003，27(6):584-586.

［6］Kerr J F，Wyllie A H，Currie A R.Apoptosis:A basic biological phenomenon with wideranging implications in tissue kinetics［J］.British Journal of Cancer，1972，26(4):239-257.

［7］周曉舟，陳國平.植物細(xì)胞程序化死亡的形態(tài)學(xué)和生理生化特征［J］.廣西植物，2007，27(3):522-526.

［8］Mittler R，Lam E.Identification，characterization，and purification of a tobacco endonuclease activity induced upon hypersensitive response cell death［J］.The Plant Cell，1995，7(11):1951-1962.

［9］支立峰，余濤，朱英國，等.鎘脅迫引起煙草懸浮細(xì)胞程序性死亡［J］.武漢植物學(xué)研究，2006，24(5):403-407.

［10］Moharikar S，D’Souza J S，Rao B J.A homologue of the defender against the apoptotic death gene(dad1)in UV-exposed Chlamydomonas cells is downregulated with the onset of programmed cell death［J］.Journal of Biosciences，2007，32(2):261-270.

［11］趙文.水生生物學(xué)［M］.北京:中國農(nóng)業(yè)出版社，2005:519-526.

［12］Stobart A K，Griffiths W T，Bukhari I A，et al.The effect of Cd(Ⅱ)on the biosynthesis of chlorophyll in leaves of barley［J］.Physiologia Plantarum，1985，63(3):293-298.

［13］邵世光，閻斌倫，許云華，等.Cd(Ⅱ)對條斑紫菜毒害作用的研究［J］.河南師范大學(xué)學(xué)報，2006，34(2):113-116.

［14］Shaw J R，Colbourne J K，Daavey J C，et al.Gene response profiles for Daphnia pulex exposed to the environmental stressor cadmium reveals novel crustacean metallothioneins［J］.BMC Genomics，2007(8):477-497.

［15］王煥校.污染生態(tài)學(xué)［M］.北京:高等教育出版社，2000.

［16］翟彩霞，馬春紅，王立安，等.玉米在誘導(dǎo)抗病過程中丙二醛(MDA)含量的變化［J］.玉米科學(xué)，2005，13(1):77-78，82.

［17］常福辰，施國新，丁小余，等.Cd2+，Hg2+復(fù)合污染下金魚藻的細(xì)胞膜脂過氧化和抗氧化酶活性的變化［J］.南京師范大學(xué)學(xué)報，2002，25(1):44-48.

［18］Li M，Zhu Q，Hu C W，et al.Cobalt and manganese stress in the microalga Pavlova viridis(Prymnesiophyceae):Efects on lipid peroxidation and antioxidant enzymes［J］.Journal of Environmental Sciences，2007，19(11):1330-1335.

［19］Chernikova T，Robinson J M，Lee E H，et al.Ozone tolerance and antioxidant enzyme activity in soybean cultivars［J］.Photosynthesis Research，2000，64(1):15-26.

［20］田丹，趙文，王媛，等.鎘脅迫對兩種海洋微藻生長和抗氧化系統(tǒng)的影響［J］.大連海洋大學(xué)學(xué)報，2010，25(5):417-421.

［21］龐戰(zhàn)軍，周玫，陳瑗.自由基醫(yī)學(xué)研究方法［M］.北京:人民衛(wèi)生出版社，2000:259-271.

［22］Gulbins E，Dreschers S，Bock J.Role of mitochondria in apoptosis［J］.Experimental Physiology，2003，88(1):85-90.

［23］Hengartner M O.The biochemistry of apoptosis［J］.Nature，2000，407:770-776.

［24］Liu G W，Gong P S，Zhao H G，et al.Effect of low-level radiation on the death of male germ cells［J］.Radiation Research，2006，165(4):379-389.