黑木耳菌絲及子實體對鉻的富集研究*

柴紅梅，汪祿祥，和麗忠，趙 靜，黎其萬，趙永昌**

(1.云南省農(nóng)科院生物技術(shù)與種質(zhì)資源研究所，云南 昆明 650221；2.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所，云南 昆明 650221)

我國是食用菌資源最豐富的國家之一，已知接近2 000種，而且近年我國的食用菌栽培產(chǎn)量也高居世界之首。除味道鮮美、是人們喜愛的佐食佳品外，食用菌還含有豐富的營養(yǎng)成份和保健成份，被聯(lián)合國推薦為21世紀(jì)的健康食品。但近年的研究顯示食用菌對多種重金屬具有高的富集特性，這提示要更加關(guān)注食用菌的栽培和食用安全性。

黑木耳 (Auricularia auricula-judae)是廣受歡迎、食用較多的一種食用菌，野生種在全國大部分地區(qū)有分布，在東北三省和廣東、福建等多省還有大面積袋料栽培。鉻是食用菌中最常見的污染重金屬元素之一，我國的衛(wèi)生指標(biāo)要求黑木耳中鉻濃度要小于1.0 mg·kg-1[1]。本研究中，選擇了黑木耳的2株野生菌株和2株栽培菌株，通過在液體培養(yǎng)基和袋料栽培基質(zhì)中人為添加重金屬鉻，分析不同菌株菌絲體和子實體對鉻的富集特性，以期為黑木耳低鉻富集菌株的篩選打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 黑木耳菌株

菌株YAASM1399和YAASM1402為野生菌株，分別采集于云南省劍川縣和永平縣。菌株YAASM2691和YAASM2692為栽培菌株，由吉林農(nóng)大提供，原編號為B12和 B13。

1.1.2 試劑

氯化鎘 (CdCl2·2.5H2O)為國產(chǎn)分析純試劑，試驗用標(biāo)準(zhǔn)溶液按GB/T602-2002《化學(xué)試劑-雜質(zhì)測定用標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備》中的方法配制。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)基配方

液體培養(yǎng)基配方：蛋白胨0.2%、酵母粉0.2%、葡萄糖2%。

袋料栽培配方：雜木屑78%、粗麥麩20%、白糖1%、石膏1%，水份含量60%~65%。

1.2.2 黑木耳菌絲體對鉻的富集試驗

設(shè)定 4 個鉻處理濃度為 1 mg·L-1、2 mg·L-1、5 mg·L-1、10 mg·L-1，以不添加鉻的搖瓶為對照，每個菌株每個處理設(shè)3個重復(fù)。接種5片已活化菌塊 (D=5 mm)于裝有100 mL培養(yǎng)液的250 mL三角錐形瓶中，180 r·min-1、25℃暗培養(yǎng)20 d。發(fā)酵液經(jīng)80目紗布過濾后，所得菌絲體用無菌蒸餾水沖洗3次，60℃烘干至恒重，記錄菌絲體干重，測量菌絲體中的鉻濃度。

1.2.3 黑木耳子實體對鉻的富集試驗

采用常規(guī)袋栽技術(shù)，選用長30 cm、寬15 cm、厚0.025 cm的高密度聚乙烯袋，每袋裝料1 kg（濕重）。將試驗用的鉻標(biāo)準(zhǔn)溶液混勻于拌料用水中，再與栽培料充分拌勻。設(shè)7個鉻處理濃度，以不添加鉻的菌袋為對照，每個菌株每個處理設(shè)15個重復(fù)（15袋）。培養(yǎng)料滅菌后，每個處理濃度取樣3份，檢測其中鉻的實際濃度（干重）。按常規(guī)方法接種和出菇管理，第1潮菇全部采收，60℃烘干至恒重，檢測子實體中的鉻濃度。

1.2.4 重金屬鉻含量的測定

樣品用硝酸-高氯酸消解，電感耦合等離子體質(zhì)譜儀測定鉻濃度。

2 結(jié)果

2.1 4株黑木耳菌株菌絲體生物量及鉻濃度

4株黑木耳菌株菌絲體生物量及鉻的含量見表1。隨

表1 4株黑木耳菌株菌絲體生物量及Cd的含量

著鉻濃度增加，兩栽培菌株的生物量呈快速下降趨勢，當(dāng)鉻濃度為5 mg·L-1時，菌絲體干重已低于兩野生菌株在鉻濃度10 mg·L-1時的菌絲體干重，而當(dāng)鉻濃度達(dá)到10 mg·L-1時，兩栽培菌株已幾乎不生長。在鉻濃度低于2 mg·L-1時，野生菌株YAASM1399的生物量比對照有小幅增加，說明低鉻濃度對它的生長有促進(jìn)作用，這與某些文獻(xiàn)報道相同[2，3]。

液體培養(yǎng)基中鉻的本底濃度為0.003 mg·L-1，因此即使添加的鉻濃度為0，菌絲體中仍檢測到了低濃度的鉻。隨著培養(yǎng)液中鉻濃度的增加，菌絲體中的鉻濃度在極顯著增加，但相互間沒有呈線性相關(guān)。在鉻濃度10 mg·L-1的培養(yǎng)液中，野生菌株YAASM1399和YAASM1402菌絲體中的鉻濃度分別達(dá)到631.84 mg·kg-1和680.16 m·kg-1的較高值，而栽培菌株YAASM2691和YAASM2692不生長，因此沒能得到相關(guān)值。

2.2 4株黑木耳菌株子實體中的鉻濃度

4株黑木耳菌株子實體中的鉻含量見表2。

隨著栽培料中鉻濃度的升高，4株黑木耳菌株子實體中的鉻濃度也在增加，但增加的趨勢較為平緩。

0.18 mg·kg-1為培養(yǎng)料中鉻濃度的背景值，此時4株黑木耳菌株子實體中的鉻濃度都未超過1.0 mg·kg-1。除菌株YAASM1402在培養(yǎng)料中鉻濃度小于1 mg·kg-1時的子實體鉻富集倍數(shù)在3.0~5.1之間外，其余菌株在不同鉻濃度的子實體富集倍數(shù)都在較低的0.5~2.6之間變動。2株野生菌株YAASM1399和YAASM1402隨著培養(yǎng)料中鉻濃度增加，子實體中鉻富集倍數(shù)呈下降趨勢。當(dāng)培養(yǎng)料中鉻濃度達(dá)到實驗添加的最高值18.46 mg·kg-1時，只有菌株YAASM2692子實體中的鉻濃度超過了這個值達(dá)到28.88 mg·kg-1，其它3株菌株子實體中的鉻濃度都低于培養(yǎng)料中的濃度，富集倍數(shù)都低于1。

2.3 同一菌株菌絲體及子實體中鉻濃度的比較

因袋料栽培時菌絲體與培養(yǎng)料難以分開，所以較難單獨測定此時菌絲體中的鉻濃度，因此用搖瓶培養(yǎng)菌絲體中的鉻濃度作為參考數(shù)值來比較。

從圖1、圖2、圖3、圖4看出，隨著培養(yǎng)基中鉻濃度的增加，4株黑木耳菌株子實體中的鉻濃度呈緩慢增加，而菌絲體中的鉻濃度急劇增加，在培養(yǎng)基中鉻濃度相同條件下，菌絲體中鉻濃度是子實體中的10倍~20倍。

大型真菌對重金屬的耐受及富集能力與環(huán)境因素和大型真菌自身因素都有關(guān)[4,5]，Baldrian發(fā)現(xiàn)側(cè)耳（Pleurotus ostreatus） 在實驗室條件下即使1 mmol·L-1鉻濃度時都不能生長，但在稻草或土壤中能夠耐受5 mmol·L-1的鉻濃度[6]。本研究中，在搖瓶液態(tài)培養(yǎng)時，培養(yǎng)基中鉻濃度為10 mg·L-1時，2株栽培菌株已不能生長，兩株野生菌株雖然生長，但生物量很低，而菌絲中的鉻濃度達(dá)到631.84 mg·kg-1，680.16 mg·kg-1的較高值。在袋料栽培固態(tài)培養(yǎng)時，即使培養(yǎng)料中鉻濃度達(dá)到18.46 mg·kg-1，4株黑木耳菌株都能生長、出菇，只有菌株YAASM2692子實體中的鉻富集倍數(shù)超過1達(dá)到1.6，其它3株菌株子實體中的鉻濃度都低于培養(yǎng)料中的濃度，富集倍數(shù)都低于1。由此可見，黑木耳菌株對鉻的耐受及富集能力與栽培環(huán)境和菌株都有很大關(guān)系。

3 討論

食用菌富集重金屬的特性取決于兩方面因素，一是生長環(huán)境，如土壤、栽培基質(zhì)、空氣、水等；二是食用菌自身的因素，如菌絲體和子實體的組織結(jié)構(gòu)、形態(tài)特征、生長發(fā)育特性等[7]。研究表明，一種食用菌對不同重金屬的富集是不同的，如巴西蘑菇子實體富集鉻能力較強(qiáng)，達(dá)13 mg·kg-1～23 mg·kg-1，而 Pb、As、Hg 含量基本正常[8]。不同種類、同種內(nèi)不同菌株間、子實體不同部位之間對同一重金屬的富集程度和含量也有差異[9]。徐麗紅等分析3個香菇品種對鉻的富集能力，其富集系數(shù)分別為12.47、12.09、8.57[10]。Garcia等在研究中發(fā)現(xiàn)，雞腿菇菌褶中Pb含量平均達(dá)2.06 mg·kg-1，而其余部分Pb含量可以達(dá)到平均2.79 mg·kg-1[11]。

表2 4株黑木耳菌株子實體中的鉻含量

圖1 菌株YAASM1399菌絲體和子實體中的鉻濃度比較

圖2 菌株YAASM1402菌絲體和子實體中的鉻濃度比較

圖3 菌株YAASM2691菌絲體和子實體中的鉻濃度比較

圖4 菌株YAASM2692菌絲體和子實體中的鉻濃度比較

本研究中，培養(yǎng)基質(zhì)中鉻濃度相同的情況下，黑木耳菌株液態(tài)搖瓶培養(yǎng)的菌絲體中鉻濃度是固態(tài)袋料栽培子實體中鉻濃度的10倍～20倍。菌絲體和子實體中重金屬元素含量與基質(zhì)的組成和性質(zhì)有很大關(guān)系[12]。液體培養(yǎng)基與袋料栽培培養(yǎng)基除組成成份不同外，pH、氧化-還原電位、有機(jī)物含量及其它競爭性金屬離子的含量也不同。液態(tài)培養(yǎng)時，新生的菌絲體完全浸沒在含鉻的液體環(huán)境中，大量鉻離子吸附在菌絲細(xì)胞表面，當(dāng)細(xì)胞壁上的結(jié)合點達(dá)到飽和時，重金屬離子將進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)中。而袋料栽培出菇時，菇體菌絲已離開培養(yǎng)基，新生菇體菌絲的營養(yǎng)需通過菌絲細(xì)胞間的運輸來供給，而前期菌絲細(xì)胞會通過一些機(jī)制來降低鉻離子對自身的傷害，因此運送到菇體菌絲的鉻離子濃度會大大降低，這些因素或許可以推測為何菌絲體與子實體中鉻濃度會相差如此之大。這也提示我們即使是在鉻污染嚴(yán)重的野生或人工栽培環(huán)境下，黑木耳菌株仍然能生長、出菇，因此栽培時嚴(yán)格控制培養(yǎng)基質(zhì)和生長環(huán)境不被鉻污染是很重要的。

我國的衛(wèi)生指標(biāo)要求黑木耳中鉻濃度小于1.0mg·kg-1，從實驗結(jié)果看出，當(dāng)培養(yǎng)料本底鉻濃度為0.18 mg·kg-1時，4株黑木耳菌株子實體中的鉻都低于1.0 mg·kg-1，均符合標(biāo)準(zhǔn)，但當(dāng)培養(yǎng)料中鉻濃度達(dá)到0.61 mg·kg-1時，只有菌株YAASM2692的子實體中鉻濃度為0.74 mg·kg-1，其它菌株子實體中的鉻濃度均已超標(biāo)。因不同菌株對鉻的富集能力不同，因此很難得出黑木耳培養(yǎng)基鉻污染臨界指標(biāo)，選擇對重金屬富集程度低的優(yōu)異菌株是食品安全的關(guān)鍵之一。本研究中的4株菌株都還不符合要求，選育工作需繼續(xù)進(jìn)行下去。

[1]周啟星，安鑫龍，魏樹和.大型真菌重金屬污染生態(tài)學(xué)研究進(jìn)展與展望[J].應(yīng)用生態(tài)學(xué)報，2008，19 (8)：1848-1853.

[2]楊春香，林新堅，林躍鑫.鎘 (Cd)對姬松茸菌絲生長的影響[J].中國食用菌，2004，23 (4)：36-38.

[3]安鑫龍，周啟星，李婷.羊肚菌菌絲體對鎘、鉛及其復(fù)合污染的生長與富集響應(yīng)[J].應(yīng)用基礎(chǔ)與工程科學(xué)學(xué)報，2008，16 (1)：35-42.

[4]安鑫龍，周啟星.大型真菌對重金屬的生物富集作用及生態(tài)修復(fù)[J].應(yīng)用生態(tài)學(xué)報，2008，18 (8)：1897-1902.

[5]劉劍飛，胡留杰，廖郭秀，等.食用菌生物修復(fù)重金屬污染研究進(jìn)展[J].應(yīng)用生態(tài)學(xué)報，2011，22 (2)：543-548.

[6]Petr B,Jiri G.Lignocellulose degradation by Pleurotus ostreatus in the presence of cadmium[J].FEMS Microbiology Letters,2003,220 (2)：235-240.

[7]周啟星，安鑫龍，魏樹和.大型真菌重金屬污染生態(tài)學(xué)研究進(jìn)展與展望[J].應(yīng)用生態(tài)學(xué)報，2008，19 (8)：1848-1853.

[8]李開本，陳體強(qiáng)，徐潔，等.巴西蘑菇富鎘特性研究初報[J].食用菌學(xué)報，1999，6 (1)：55-57.

[9]黃晨陽，張金霞.食用菌重金屬富集研究進(jìn)展[J].中國食用菌，2004，23 (4)：7-9.

[10]徐麗紅，吳應(yīng)淼，葉長文，等.重金屬鎘在香菇品種中的積累比較[J].食用菌學(xué)報，2006，13 (4)：91-92.

[11]Garcia MA,Alonso J,Fernandez MI,et al.Lead content in edible wild mushrooms in northwest Spain as indicator of environmental contamination[J].Arch Environ Contam&Toxicol,1998,34 (4)：330-335.

[12]于德洋，程顯好，羅毅，等.大型真菌重金屬富集的研究進(jìn)展[J].中國食用菌，2011，30 (1)：10-13.