巴西蘑菇液體搖瓶培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件的優(yōu)化

聶建軍，李彩萍，楊玉畫，李兆斌

（1.山西省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)資源與經(jīng)濟研究所，山西 太原 030006；2.山西省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)環(huán)境與資源研究所，山西 太原 030006）

巴西蘑菇（Agaricus blazei Murrill），又名姬松茸、柏氏蘑菇、小松菇，屬真菌門（Eumycota）、擔子菌亞門（Basidiomycotina）、層菌綱（Hymenomycetes），傘菌目（A－garicales）、蘑菇科 （Agaricaceae）、蘑菇屬 （Agaricus）。

巴西蘑菇原產(chǎn)于巴西和秘魯，日本人首先引種栽培成功，將它取名為“姬松茸”。巴西蘑菇營養(yǎng)豐富，所含多糖、糖蛋白復合體、甾醇類物質具有提高機體免疫力、抗癌、抗病毒等功效，尤其多糖含量高于一般的食用菌，抗腫瘤活性遠高于靈芝，且口服效果不遜于注射，被日本醫(yī)學界稱為“地球上腫瘤患者最后的食品”。巴西蘑菇產(chǎn)品市場價格始終居高不下，是一種極具開發(fā)價值的珍貴食藥用菌。但是，巴西蘑菇的子實體培養(yǎng)很困難，產(chǎn)量非常有限，遠不能滿足市場的需求，所以采用液體深層培養(yǎng)的方法大規(guī)模生產(chǎn)巴西蘑菇菌絲體及其發(fā)酵液，開發(fā)出各種相關產(chǎn)品，具有很大的市場潛力[1-4]。本項研究對巴西蘑菇液體搖瓶培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件進行了優(yōu)化，旨在為把液體搖瓶培養(yǎng)的菌絲體作為中間過渡菌種而進一步擴大深層培養(yǎng)奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

巴西蘑菇（Agaricus blazei Murrill）MH1菌株，由山西省農(nóng)科院食用菌研究所提供。

1.2 供試培養(yǎng)基

1.2.1 母種培養(yǎng)基

采用馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基（PDA）培養(yǎng)基。

1.2.2 碳源基礎培養(yǎng)基

蛋白胨0.5%、KH2PO40.2%、MgSO40.1%，pH值自然。

1.2.3 氮源基礎培養(yǎng)基

葡萄糖2%、KH2PO40.2%、MgSO40.1%，pH值自然。

1.2.4 試驗培養(yǎng)基

將葡萄糖、蔗糖、玉米粉、乳糖、甘露醇和山梨糖分別加入碳源基礎培養(yǎng)基中（濃度均為2%），進行碳源優(yōu)化試驗；將蛋白胨、酵母膏、硝酸銨、尿素、豆餅粉和麩皮分別加入氮源基礎培養(yǎng)基中（濃度均為0.5%），進行氮源優(yōu)化試驗。

1.2.5 優(yōu)化培養(yǎng)基

根據(jù)1.2.4中碳、氮源單因素試驗結果，選擇較好的碳、氮源各2個，進行L9(34)正交試驗[5]。以葡萄糖（A）和玉米粉（B） 為復合碳源，酵母膏（C） 和豆餅粉（D）為復合氮源，采用4因素3水平正交試驗方法，篩選出巴西蘑菇液體搖瓶最佳培養(yǎng)基。

1.3 試驗方法

1.3.1 菌種活化與純化培養(yǎng)

將巴西蘑菇菌種從冰箱中取出后，25℃下恒溫放置7 d，使處于低溫中的菌種活化；無菌條件下把活化菌種接種于馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基平板上，28℃下恒溫培養(yǎng)3 d~4 d，之后挑取強壯菌絲體前端，接種于斜面培養(yǎng)基上，28℃下恒溫培養(yǎng)至斜面長滿，得一級菌種備用。

1.3.2 碳 (氮)源篩選試驗

取3塊0.5 cm2巴西蘑菇一級菌種，分別接種于不同碳（氮）源培養(yǎng)基中，500 mL三角瓶裝液體培養(yǎng)基100 mL，使氣生菌絲一面向上懸浮，25℃下靜置24 h；然后放入往復式搖床內(nèi)，25℃，150 r·min-1條件下培養(yǎng)7 d。每種碳（氮）源試驗重復5次，結果取平均值。

1.3.3 培養(yǎng)基篩選

把巴西蘑菇一級菌種分別接入不同的正交試驗培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件同1.3.2，篩選出最佳培養(yǎng)基配方。試驗因素及其各水平如表1所示。

表1 培養(yǎng)基正交試驗的因素及水平

1.3.4 培養(yǎng)條件篩選

以篩選出的培養(yǎng)基為培養(yǎng)基。一級搖瓶500 mL三角瓶裝100 mL培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件同1.3.2；在160 r·min-1的轉速下，二級搖瓶500 mL三角瓶的裝液量、接種量、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)天數(shù)按正交試驗處理。試驗因素及其各水平如表2所示。

表2 培養(yǎng)條件正交試驗的因素及水平

1.4 測定方法

1.4.1 菌球密度的測定

用吸管吸取1 mL培養(yǎng)液在玻璃板上攤成薄薄的1層，用接種針將菌球分開，進行直觀計數(shù)，如此重復5次，取其平均值。

1.4.2 菌球直徑的測定

隨機取菌球30個，排列成直線，并測其總長度，求得菌球的平均直徑。

1.4.3 生物量的測定

取培養(yǎng)好的菌絲體液在3 000 r·min-1的條件下離心10 min，蒸餾水洗滌，再離心，倒去上清液，菌絲體在60℃下烘干至恒重，稱量。

2 結果與分析

2.1 碳源篩選試驗結果

碳源篩選試驗結果見表3。

表3 不同碳源對巴西蘑菇菌絲體生長的影響

從表3可以看出，葡萄糖作為碳源，其平均菌絲體生物量最高，達12.28 g·L-1；平均菌球密度最大，約為223個·mL-1；平均菌球直徑較小，為1.68 mm。綜合比較，葡萄糖作為巴西蘑菇液體搖瓶培養(yǎng)基碳源效果最佳，其次是玉米粉、蔗糖等。

2.2 氮源篩選試驗結果

氮源篩選試驗結果見表4。

表4 不同氮源對巴西蘑菇菌絲體生長的影響

從表4可以看出，酵母膏作為氮源，其平均菌絲體生物量最高，達13.32 g·L－1；平均菌球密度較大，為228個·mL－1；平均菌球直徑較大，為1.81 mm。綜合比較，酵母膏作為巴西蘑菇液體搖瓶培養(yǎng)基氮源效果最佳，其次是豆餅粉、蛋白胨等。

2.3 正交試驗優(yōu)化巴西蘑菇液體搖瓶培養(yǎng)基結果

L9(34)正交試驗結果與極差分析結果見表5。

表5 培養(yǎng)基配方正交試驗結果

從表5可以得出，影響巴西蘑菇菌絲體生物量的因素依次為A＞C＞D＞B，即葡萄糖＞酵母膏＞豆餅粉＞玉米粉；巴西蘑菇液體搖瓶最佳培養(yǎng)基組合為A2B2C3D2，即葡萄糖2%、玉米粉2%、酵母膏0.75%、豆餅粉2%、KH2PO40.2%、MgSO40.1%。

2.4 正交試驗優(yōu)化巴西蘑菇液體搖瓶培養(yǎng)條件結果

L9(34)正交試驗結果與極差分析見表6。

從表6可以得出，影響巴西蘑菇菌絲體生物量的因素依次為D＞C＞B＞A，即接種量＞裝液量＞培養(yǎng)天數(shù)＞培養(yǎng)溫度；巴西蘑菇液體搖瓶最佳培養(yǎng)條件為A3B2C3D3，即培養(yǎng)溫度28℃，8 d，裝液量150 mL，接種量15%。

3 結論

通過篩選試驗發(fā)現(xiàn)，巴西蘑菇液體搖瓶培養(yǎng)基最佳碳源是葡萄糖，最佳氮源是酵母膏。培養(yǎng)基中的玉米粉和豆餅粉來源廣泛、價格低廉、營養(yǎng)豐富，可以顯著降低生產(chǎn)成本，是大規(guī)模生產(chǎn)巴西蘑菇液體菌種的最佳原料。

表6 培養(yǎng)條件正交試驗結果

采用正交試驗方法篩選巴西蘑菇液體搖瓶培養(yǎng)基配方，結果表明，巴西蘑菇液體搖瓶最佳培養(yǎng)基為葡萄糖2%、玉米粉 2%、酵母膏0.75%、豆餅粉2%、KH2PO40.2%、MgSO40.1%，最佳培養(yǎng)條件為裝液量每500 mL裝150 mL，接種量 15%，轉速 160 r·min－1，培養(yǎng)溫度 28℃，8 d。

搖瓶的裝液量和搖床的轉速決定了培養(yǎng)液溶氧量的大小。本試驗是在設定搖瓶轉速而改變裝液量的前提下優(yōu)化出了最佳培養(yǎng)條件，但轉速是否最佳，對產(chǎn)生的巴西蘑菇菌絲體生物量是否有影響，有待進一步研究。

[1]隅谷立光，黃年來.巴西蘑菇[J].中國食用菌，2001，20(2)：6－7.

[2]陳智毅，李清兵.巴西蘑菇的食療價值[J].中國食用菌，2002，20(4)：4－6.

[3]Iwade T,Ito H.Miracle Himenmatsutake[M].Tokyo:Chikyu－sha,1982.

[4]張勝友.新法栽培巴西蘑菇[M].武漢：華中科技大學出版社，2010.

[5]杜榮騫.生物統(tǒng)計學[M].北京：高等教育出版社，2003.