抑制物對草菇生長的影響1)

侯立娟 李 玉 孟 麗

(食藥用菌教育部工程研究中心(吉林農(nóng)業(yè)大學)，長春，130118)

陳明杰 John Buswell

(上海市農(nóng)業(yè)科學院食用菌研究所)

宋金俤

(江蘇省農(nóng)業(yè)科學院蔬菜研究所)

草菇起源于中國，距今已有300多年的歷史［1］，因其品質(zhì)鮮嫩，味道鮮美，肉質(zhì)細膩，享有“素中之葷”的美稱，加工的干制品，香味更加濃郁。草菇中Vc、蛋白質(zhì)、脂肪和糖類的含量較高，并含有人體必需的8種氨基酸［2］以及一種異體蛋白，可增強人體的抗癌能力。草菇中還含有非飽和脂肪酸，可以抑制人體對膽固醇的吸收，促進膽固醇分解為膽酸，降低血液中膽固醇的濃度，改善血管的彈性，對防治心腦血管疾病有較好作用［3－5］。因此，以草菇為原料的制成品，如草菇醬油等［6－8］倍受國內(nèi)外青睞。但草菇與其他的大宗食用菌相比，產(chǎn)量偏低。目前，國內(nèi)外對于草菇栽培的文獻報道較多［9－16］，但是對于影響草菇產(chǎn)量的研究尚未見報道。有關(guān)文獻報道了雙孢蘑菇產(chǎn)量降低的原因之一是存在抑制物，國外的一些學者認為是積累了有毒的代謝產(chǎn)物，或微量元素［17－19］，也有學者認為是微生物的競爭等導致產(chǎn)量下降［20－21］?？紤]到雙孢蘑菇和草菇同是草腐菌，對影響草菇產(chǎn)量的研究可以借鑒影響雙孢蘑菇產(chǎn)量的研究。因此，本研究從影響草菇產(chǎn)量因素之一的抑制物進行研究，以期找到影響草菇產(chǎn)量的抑制物，為解決草菇的實際生產(chǎn)問題奠定基礎(chǔ)和提供思路。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

草菇菌株V23，由上海農(nóng)業(yè)科學院食用菌所菌種保藏中心提供。

大腸桿菌感受細胞DH5α(天根生化科技(上海)有限公司)。

1.2 培養(yǎng)基

栽培培養(yǎng)基 95%廢棉，5%輕質(zhì)碳酸鈣。

液體基本培養(yǎng)基(1 L):磷酸二氫鉀1.0 g，磷酸氫二鉀 0.4 g，硫酸鎂 0.5 g，氯化鈣 0.013 g，硝酸銨0.5g，酵母膏0.1g，L－天冬酰胺1.5g，維生素B10.0025 g，吐溫－802.0 mL，微量元素溶液 1.0 mL，葡萄糖(10 g)10 g，用KOH(2 mol/L)和HCl(2 mol/L)將培養(yǎng)基調(diào)至 pH=6.0。

微量元素溶液配方(1 L):檸檬酸鐵4.8 g，Zn-SO4·7H2O 2.64 g，MnCl2·4H2O 2.0 g，CoCl2·6H2O 0.4 g，CuSO4·5H2O 0.4 g。

PDA培養(yǎng)基 馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，加蒸餾水至1000 mL，液體培養(yǎng)基不加瓊脂。

LB液體培養(yǎng)基 10 g胰化蛋白胨，5 g酵母提取物，10 g NaCl，NaOH 調(diào)節(jié) pH 至 7.0，蒸餾水定容至1 L。

LB固體培養(yǎng)基 15 g瓊脂加入到1 L的LB液體培養(yǎng)基。

LB+AP培養(yǎng)基 每20 mL LB培養(yǎng)基含20 μL(50 g/L)氨芐青霉素。

LB+AP+IPTG+X－gal平板 將含有20 μL(50 g/L)氨芐青霉素添加到LB培養(yǎng)基中，制成平板，然后將40 μL(20 g/L)X－gal和 4 μL(200 g/L)IPTG涂布于平板上。

1.3 栽培試驗

將自然發(fā)酵的培養(yǎng)料分成3個組。分別為:A組——稱量培養(yǎng)料 4.5 kg，接種 0.4 kg，菌種 V23。將處理的培養(yǎng)料全部封閉，經(jīng)121℃滅菌2 h。滅菌后冷卻至室溫備用。培養(yǎng)過程均處于封閉狀態(tài)。B組——稱量培養(yǎng)料4.5 kg，不接菌種。C組——稱量培養(yǎng)料 4.5 kg，接種 0.4 kg，菌種 V23。

將3組培養(yǎng)料分別放在人工環(huán)境栽培箱中，菌絲生長階段栽培箱最低溫度設(shè)置為32℃，最高溫度設(shè)置成34℃;最高濕度設(shè)置為85%，最低濕度設(shè)置80%;CO2的最低質(zhì)量濃度為1500 g/m3，最高質(zhì)量濃度為2000 g/m3。生殖生長時期，栽培箱最高溫度設(shè)置為32℃，最低設(shè)置為30℃;最高濕度設(shè)置為95%，最低濕度設(shè)置90%;CO2的最低質(zhì)量濃度為1000 g/m3，最高質(zhì)量濃度為1300 g/m3。每組均做3個重復。

1.4 提取液的制備

取經(jīng)過一個栽培周期后的A、B、C 3組培養(yǎng)料，按照m(培養(yǎng)料)∶m(水)=1∶4分別制備提取液。每組提取液分別進行4種處理:T1——提取液經(jīng)121℃高壓滅菌 20 min;T2——提取液用 0.22 μm濾膜過濾除菌;T3——提取液用0.22 μm濾膜過濾后再121℃高溫滅菌20 min;T4——提取液不做任何處理。

1.5 液體培養(yǎng)

1)以20 g/L的提取液(A、B、C組培養(yǎng)料經(jīng)4種不同處理得到)分別加入草菇液體基本培養(yǎng)基(100 mL)中，再加入2 mL菌株V23，32℃搖床培養(yǎng)5 d。每個提取液進行3個重復，配方詳見表1。

表1 不同處理的培養(yǎng)基配方 mL

2)將 100、250、500 g/L(100 mL 的液體培養(yǎng)基中，提取液分別占10%、25%、50%)的提取液(C組的T1處理得到)分別加入草菇液體基本培養(yǎng)基(100 mL)中，再加入2 mL菌株V23，32℃搖床培養(yǎng)5 d。每個提取液進行3個重復，配方詳見表2。

表2 不同處理培養(yǎng)基配方 mL

3)將質(zhì)量濃度為1000 g/L的提取液(C組經(jīng)T1和T2處理得到)加入草菇液體基本培養(yǎng)基(50 mL)中，再加入1 mL菌株V23，32℃搖床培養(yǎng)5 d。每個提取液進行2個重復。

4)將質(zhì)量濃度為1000 g/L的提取液分為兩組:一組加基本培養(yǎng)基，另一組不加培養(yǎng)基，將以上兩組又再次分為兩個處理，即C組經(jīng)T1和T2處理得到，均接種V23菌種1 mL，32℃搖床兩組同時培養(yǎng)5 d。每個提取液2個重復。

1.6 微生物的分子檢測

對B組和C組經(jīng)T4處理得到的未知物進行分子檢測。

DNA的提取 采用改進的CTAB法提取基因組 DNA［22］。

DNA質(zhì)量檢測 用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質(zhì)量，在0.5×TBE緩沖液中，5 V/cm電壓下電泳;電泳結(jié)束后，以質(zhì)量濃度為0.5 g/L的EB染色，用EC3 Imaging System凝膠成像系統(tǒng)觀察并記錄結(jié)果。

PCR擴增 1)PCR反應所用引物。PCR擴增引物為ITS1和ITS4，由北京三博遠志生物技術(shù)有限責任公司合成，引物堿基序列見表3。2)ITS擴增采用的反應體系和反應條件。PCR擴增體系(25 μL)各組分為:10×PCR buffer 2.5 μL，MgCl2(25 mol/L)2 μL，dNTP(10 mol/mL)0.5 μL，ITS1(25 mol/mL)0.5 μL，ITS4(25 mol/mL)0.5 μL，模板 DNA(50 mg/L)0.5 μL，Taq DNA 聚合酶(10 mol/mL 5 U/μL)0.5 μL，蒸餾水18 μL。PCR擴增反應程序的熱循環(huán)參數(shù)為94℃預變性2 min，然后進入連續(xù)30個循環(huán):94 ℃變性15 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，循環(huán)結(jié)束后在72℃再延伸10 min，最后4℃保存。3)PCR產(chǎn)物電泳檢測。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測、EB染色后，在EC3 Imaging System凝膠成像系統(tǒng)(SYNGENE公司)下觀察結(jié)果并拍照。4)PCR產(chǎn)物的回收。本試驗使用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit(Axygen Biosciences，USA)進行回收。5)連接反應。PCR純化產(chǎn)物，用pGEM－T試劑盒進行連接反應體系，如表4所示。6)反應條件。4℃連接過夜。7)克隆轉(zhuǎn)化。將連接產(chǎn)物加入100 μL冰浴融化的感受態(tài)細胞中混合，冰浴30 min;在42℃水浴中熱擊90 s后，迅速將管子移到冰浴中，使細胞冷卻2 min;向連接反應轉(zhuǎn)化細胞中加入800 μL LB 培養(yǎng)基混勻，37 ℃，150 r/min，培養(yǎng)1.5 h;培養(yǎng)結(jié)束前40 min，在含有 AP的 LB平板上涂布 4 μL IPTG(200 g/L)和 40 μL X－gal(20 g/L)混合物，然后將平板置于培養(yǎng)箱內(nèi)37℃使其吸收;培養(yǎng)結(jié)束后，取100 μL菌液涂布于平板上，37℃過夜培養(yǎng)，然后挑單菌落。

表3 引物序列

表4 連接的反應體系

克隆驗證PCR 1)PCR反應體系見表5所示。2)擴增程序。PCR擴增反應程序的熱循環(huán)參數(shù):95℃預變性5 min，連續(xù)30個循環(huán)，94℃變性30 s，45℃退火30 s，72℃延伸1 min，循環(huán)結(jié)束后72℃再延伸10 min，4℃保存。3)測序。挑選3個陽性轉(zhuǎn)化子，送華大基因公司進行測序。4)比對。將序列輸入到NCBI，根據(jù)BLAST進行同源性比較分析。5)數(shù)據(jù)分析方法。采用SPASS 13.0進行數(shù)據(jù)差異顯著性分析。

表5 PCR反應體系

1.7 生物量的測定

將菌絲用蒸餾水沖洗數(shù)次并過濾，于烘箱中80℃烘干至質(zhì)量恒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 液體培養(yǎng)對草菇生長及生物量的影響

2.1.1 質(zhì)量濃度20 g/L提取液對草菇生長的影響

1)草菇生長情況見表6。A、B、C 3組的提取液經(jīng)高壓滅菌、過膜除菌、過膜后滅菌的處理后加入液體培養(yǎng)基中，均不影響草菇菌絲的生長，各組的不處理提取液加入液體培養(yǎng)基后，均抑制草菇菌絲的生長。其中B、C組長有非草菇的抑制物。

表6 20 g/L的提取液對草菇生長影響

2)生物量的測定。A組3個處理的草菇生物量見表7。與CK相比，3個處理的生物量均比CK的生物量高。其中，以過膜后滅菌處理的生物量最高，其次是滅菌處理的生物量。AT3比ATI、AT2、CK分別增加0.0155、0.0161、0.0509 g，分別提高 7.38%、7.69%、29.15%。各處理之間在 0.05 水平上差異性顯著。

表7 A組不同處理的生物量

B組的生物量見表8。與CK相比，3個處理的生物量均比CK的生物量高，各個生物量從高到低的順序為:BT3＞BT2＞BT1＞CK。BT3 比 BT2、BT1、CK 分別增 0.0221、0.0294、0.0539 g，增加幅度分別為12.66%、16.84%、30.87%。各處理在0.05 水平上差異顯著，在0.01水平上差異極顯著。

表8 B組各個處理的生物量

C組的生物量見表9。與CK相比，即過膜后滅菌(CT3)的處理加到液體培養(yǎng)基的生物量為最高，CK的生物量最低。CT1、CT2、CT3處理的生物量分別比 CK 的生物量提高15.46%、18.21%、25.43%，各處理在0.05水平上差異顯著，在0.01水平上差異極顯著。

表9 C組不同處理的生物量

比較3個組內(nèi)生物量，從高到低的順序為:A組，T3＞T1＞T2＞CK;B 組，T3＞T2＞T1＞CK;C 組，T3＞T2＞T1＞CK。即T3處理后的生物量最高，說明提取液過膜后進行高溫滅菌(T3)，更能促進草菇菌絲的生長。

組間生物量從高到低的順序為:T1，A＞C＞B組，其值依次為0.2100、0.2016、0.1967 g;T2，A＞C＞B組，其值依次為 0.2094、0.2064、0.2040 g;T3，B＞A＞C 組，生物量分別為 0.2285、0.2255、0.2190 g。

2.1.2 質(zhì)量濃度分別為 100、250、500 g/L 提取液對草菇生物量的影響

不同質(zhì)量濃度的滅菌菌糠提取液加到液體培養(yǎng)基中并沒有抑制草菇的生長。相反，隨著滅菌菌糠提取液質(zhì)量濃度的增加，其生物量也隨之增加，見表10。當提取液質(zhì)量濃度為500 g/L時，其草菇菌絲生物量為最大，是對照的3.58倍(其他處理加的是提取液，對照加的是水)。各個處理經(jīng)過SPASS13.0處理，均達到5%顯著水平或1%極顯著水平。

表10 草菇生物量的結(jié)果

2.1.3 1000 g/L草菇菌糠的提取液對草菇生長的影響

1)草菇生長情況。加入基本培養(yǎng)基和不加入基本培養(yǎng)基，草菇均能生長正常。

2)生物量的測定。將1000 g/L的草菇菌糠的提取液分為兩組，一組加合成培養(yǎng)基，一組不加合成培養(yǎng)基，每組的提取液又分為高溫滅菌和0.22 μm濾膜除菌。測定結(jié)果表明:各個處理沒有對草菇的菌絲產(chǎn)生抑制作用，生物量見表11。從表11中可以看出，與不加合成培養(yǎng)基的處理相比，提取液加入合成培養(yǎng)基后，草菇菌絲的生物量明顯增加，處理B比處理A的生物量增加2.66倍，處理D比處理C的生物量增加2.32倍。提取液經(jīng)121℃滅菌20 min與0.22 μm濾膜滅菌相比，過膜處理的提取液加到液體培養(yǎng)基中，其生物量不如提取液經(jīng)高溫滅菌處理的生物量高。

表11 各個處理的生物量

2.2 影響草菇生長的抑制物及其分子檢測

將不做任何處理(T4)的A、B、C 3組培養(yǎng)料的提取液加入液體培養(yǎng)基中，均不能長出草菇菌絲球。A組液體乳白色，渾濁，說明已被污染;B組液體清澈，長出的菌絲球形態(tài)上與正常草菇不同;C組液體清澈，僅長出幾個菌絲球，表面有裂痕，菌絲球呈白色，與正常草菇的菌絲球不同。

提取BT4和CT4不明物質(zhì)菌絲的DNA，經(jīng)過對ITS區(qū)PCR擴增得到的結(jié)果見圖1。ITS擴增試驗中，除了對TB4、TC4的DNA進行擴增，還對TC4的DNA模板的加樣量做了3個梯度分析，以草菇V23菌株為對照。BT4處理擴增出來的ITS條帶在600 bp左右，CT4擴增出2個條帶分別在500 bp和550 bp左右。BT4和CT4擴增的條帶與草菇擴增出來的條帶相比，不在同一個位置。TC4模板的3個不同加樣量比較，只有當模板為3 μL時，能擴增出2個目的條帶。

圖1 ITS擴增結(jié)果

將PCR產(chǎn)物回收、克隆驗證、測序，經(jīng)過BLAST比對，BT4 與 Hypocrea sp.有同源性;而 CT4(3 μL)的兩條帶中，由于上邊條帶模板濃度過低，沒能測出結(jié)果，下邊的條帶測出2個結(jié)果，測序后經(jīng)過BLAST比對發(fā)現(xiàn)，分別與草菇(Volvariella volvacea)和煙曲霉(Asperigillus furnig)都具有同源性，說明T4處理的提取液中混有以上2種菌絲。由于草菇是開放式的栽培環(huán)境，推測在其栽培過程中出現(xiàn)煙曲霉污染，可能由于煙曲霉生長速度較草菇菌絲生長快，比較強勢，從而抑制了草菇的生長。

3 結(jié)論與討論

3.1 草菇生長抑制物的排除

通過3組(A、B、C)不同培養(yǎng)料制備的4種(T1、T2、T3、T4)提取液，各組的 T1、T2、T3 處理均不影響草菇菌絲的生長。說明T1處理排除抑制物為真菌和化學物質(zhì)，T2排除細菌，T3排除病毒，只有各組不處理的提取液(T4)均抑制草菇生長。經(jīng)過逐步的排除后，鎖定T4的提取液是微生物或微生物的代謝產(chǎn)物，進而抑制了草菇菌絲的生長。

試驗中所用提取液的制備均是用蒸餾水制備，并沒有嘗試用乙醇、甲醇等有機溶劑提取。也有可能存在沒有檢測到的抑制物是不溶于水，而溶解在有機溶劑中;還有一種可能，即便是存在抑制物且溶于水中，但需要非室溫的提取溫度，而本試驗采用室溫進行提取，沒有嘗試不同的提取溫度對提取效果的影響等，這些都需要進一步的試驗進行探索。

3.2 不同質(zhì)量濃度提取液對草菇生長的影響

為了避免因20 g/L處理液質(zhì)量濃度較低從而稀釋了抑制物，將C組的菌糠提取液經(jīng)高壓滅菌處理，分別以質(zhì)量濃度為100、250、500 g/L進行液體培養(yǎng)，但其并沒有抑制草菇的生長，且生物量均隨質(zhì)量濃度的增大而增加，說明高溫滅菌處理的提取液含有營養(yǎng)物質(zhì)。有研究報道［23－24］，菌糠中殘留的大量菌絲體蛋白、維生素類等物質(zhì)提供的營養(yǎng)可供菌絲生長利用，與本試驗的結(jié)果相符。將C組質(zhì)量濃度為1000 g/L的提取液分為兩組:一組不加合成培養(yǎng)基，另一組加入合成培養(yǎng)基，以上兩組分別經(jīng)高壓滅菌和過膜處理，進行液體培養(yǎng)后結(jié)果顯示，經(jīng)過膜和高壓滅菌處理的提取液，均不影響草菇菌絲的生長，加入合成培養(yǎng)基的生物量高于未添加合成培養(yǎng)基，說明1000 g/L菌糠提取液含有一定的營養(yǎng)，但營養(yǎng)成分不全面;高壓滅菌處理的生物量高于過膜處理，試驗結(jié)果表明，過膜后殘留物可抑制草菇生長，高壓滅菌處理更利于草菇菌絲的生長，說明經(jīng)高壓滅菌后，更徹底地消滅了有害微生物，有利于菌絲的生長。同時，經(jīng)過高壓滅菌后，一些營養(yǎng)物質(zhì)的有效成分也部分被破壞了。

3.3 微生物的分子檢測

經(jīng)過BLAST比對發(fā)現(xiàn)，BT4與肉座菌屬有較高的同源性，說明在栽培前培養(yǎng)原料中就存在此物質(zhì)，或者是因為草菇是屬于開放式栽培，在栽培過程中培養(yǎng)料被肉座菌屬污染。而CT4經(jīng)過BLAST比對的結(jié)果是與煙曲霉同源。說明肉座菌屬和煙曲霉是抑制草菇生長的抑制物。界定本研究所采用的培養(yǎng)料和栽培環(huán)境，肉座菌屬和煙曲霉是抑制草菇生長眾多抑制物中的兩種。

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