響應(yīng)面法優(yōu)化大腸桿菌CD－2產(chǎn)偶氮還原酶培養(yǎng)基的條件1)

杜光映輝 崔岱宗 張 寧 趙 敏 李國(guó)芳 古曉旭

(東北林業(yè)大學(xué)，哈爾濱，150040)

印染和染料工業(yè)是對(duì)環(huán)境污染極其嚴(yán)重的產(chǎn)業(yè)之一。我國(guó)年產(chǎn)染料為15萬(wàn)t［1］，偶氮染料產(chǎn)量占染料總產(chǎn)量的70%左右［2］，在偶氮染料的生產(chǎn)和使用中有10% ～15%的染料隨廢水排入水系中［3］，導(dǎo)致嚴(yán)重的水污染，引起了人們的廣泛重視。偶氮染料是含有一個(gè)或多個(gè)偶氮鍵(—N=N—)的有機(jī)合成染色劑，目前廣泛地應(yīng)用于紡織、食品、藥品等工業(yè)中［4］。然而，偶氮染料在水環(huán)境中可以長(zhǎng)期穩(wěn)定存在，更為嚴(yán)重的是大部分偶氮染料及其降解產(chǎn)物具有致畸、致癌、致突變的作用［5］。這些偶氮染料的降解產(chǎn)物如果長(zhǎng)期蓄積并通過(guò)污染的水源和食物經(jīng)口進(jìn)入體內(nèi)，會(huì)引起人類的各種疾病。因此，含偶氮染料的廢水必須經(jīng)過(guò)處理才能排到水系中［6］。目前處理含偶氮染料廢水的工藝主要有物理法、化學(xué)法，如吸附、沉淀、化學(xué)氧化等，但由于這兩種方法的低效和高成本，不能大規(guī)模應(yīng)用到實(shí)際的污水處理中。生物法克服了這些缺點(diǎn)，在處理含偶氮染料廢水中有明顯的優(yōu)勢(shì)，已受到人們?cè)絹?lái)越多的關(guān)注［7－8］。生物法降解含偶氮染料廢水的高效、環(huán)保和低成本優(yōu)勢(shì)使其具備了大規(guī)模應(yīng)用的潛力。目前，對(duì)生物降解偶氮染料的研究主要集中在環(huán)境中各種微生物對(duì)偶氮染料的生物吸收和降解。近年來(lái)，能夠在厭氧條件下高效降解偶氮染料的細(xì)菌，如Bacillus sp.、Klebsiella sp.等陸續(xù)被分離［9］出來(lái)，然而，厭氧條件下偶氮染料不能被完全降解，其生成的中間產(chǎn)物芳香胺類物質(zhì)仍對(duì)環(huán)境有較大危害。所以有必要對(duì)偶氮染料在好氧條件下進(jìn)行徹底降解的可能性進(jìn)行深入研究。

筆者曾從中國(guó)海城市某紡織廠印染廢水中發(fā)現(xiàn)并分離了一株能夠在好氧條件下有效降解偶氮染料的細(xì)菌，經(jīng)生理生化特性鑒定及16S rDNA基因序列分析確定為大腸桿菌，命名為E.coli CD－2，該菌能在好氧條件、較寬的溫度、pH值和鹽度范圍下有效地降解多種偶氮染料。因此，菌株CD－2有巨大的潛力應(yīng)用于含偶氮染料的廢水處理中。本文通過(guò)前期試驗(yàn)對(duì)影響菌株CD－2的產(chǎn)偶氮還原酶培養(yǎng)基單因子條件進(jìn)行了篩選和水平分析，并利用響應(yīng)面法(RSM)對(duì)大腸桿菌CD－2的產(chǎn)偶氮還原酶培養(yǎng)基條件進(jìn)行了優(yōu)化，以提高大腸桿菌CD－2產(chǎn)偶氮還原酶的效率，為其能夠進(jìn)一步應(yīng)用于偶氮廢水處理打下堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。

1 材料

菌種 研究所用菌株是從中國(guó)海城市某紡織廠印染廢水中分離出來(lái)的，經(jīng)生理生化特性鑒定及16S rDNA基因序列分析確定為大腸桿菌，命名為Escherichia coli CD－2。

培養(yǎng)基與試劑 富集培養(yǎng)基:Luria－Bertani(LB)培養(yǎng)基;單因子優(yōu)化后的初始降解培養(yǎng)基:甘露醇 10 g·L－1、氯化銨 3 g·L－1、接菌量 2%、KH2PO45 g·L－1、Na2HPO45 g·L－1、MgCl21 g·L－1、甲基紅100 mg/L、pH 值為6.0;NADH 購(gòu)自 Sigma公司，其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

2 試驗(yàn)方法

菌種培養(yǎng) 接種Escherichia coli CD－2于100 mL LB培養(yǎng)基中，120 r/min，37℃培養(yǎng)12 h。以2%接種量接種到150 mL待優(yōu)化的培養(yǎng)基中。120 r/min，37 ℃培養(yǎng)14 h。

偶氮還原酶粗酶液的提取 將上述培養(yǎng)過(guò)的菌液10000 r/min離心5 min后去上清收集菌體，用100 mmol/L磷酸緩沖液(pH=7.0)清洗兩次，離心后用5 mL同樣的磷酸緩沖液重懸菌體，用超聲波破碎法(5 s，80%輸出功率，50次破胞)對(duì)重懸液進(jìn)行破胞處理。破碎完的重懸液10000 r/min離心15 min得到的上清即為粗酶液。

偶氮還原酶直接酶活的測(cè)定 2 mL酶活測(cè)定體系包括:0.2 mL 粗酶液、0.2 mol/L 染料、1.6 mL 100 mmol/L 磷酸緩沖液(pH=7.0)、0.2 mL 1 mmol/L的NADH，未加NADH前37℃溫浴4 min，從加入NADH時(shí)開(kāi)始計(jì)時(shí)，調(diào)至染料相應(yīng)波長(zhǎng)處測(cè)降解值，(經(jīng)過(guò)全波長(zhǎng)掃描，甲基紅波長(zhǎng)定為407 nm)一個(gè)酶活單位定義為:1 mL體系中1 min能降解1 mol染料所需要的酶量。

PB和響應(yīng)面對(duì)產(chǎn)酶培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化 通過(guò)單因子試驗(yàn)對(duì)碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽、pH和接菌量進(jìn)行篩選，得出最佳碳源為甘露醇10 g·L－1，最佳氮源為氯化銨 5 g·L－1，最適無(wú)機(jī)鹽為:KH2PO45 g·L－1、Na2HPO45 g·L－1、MgCl21 g·L－1，最佳 pH 為 6，最佳接菌量為3%。以上述單因子試驗(yàn)得出的各個(gè)因子的最佳量為中心點(diǎn)取高水平和低水平，見(jiàn)表1，利用design expert 7.0軟件中的 Plackett－Burman功能設(shè)計(jì)［10］并進(jìn)行試驗(yàn)。

表1 Plackett－Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)各因子水平

最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì) 響應(yīng)面擬合方程只有在考察的臨近區(qū)域里才能充分接近真實(shí)情況［13］，因此應(yīng)該先逼近最大產(chǎn)酶區(qū)域后再建立有效的擬合方程。根據(jù)Plackett－Burman法篩選出的顯著因子效應(yīng)大小設(shè)計(jì)它們的步長(zhǎng)，進(jìn)行最陡爬坡試驗(yàn)，以尋找最大產(chǎn)酶區(qū)。其他因子選用Plackett－Burman試驗(yàn)中1和－1水平的最大值或最小值。本試驗(yàn)采用Plackett－Burman法的1/4步長(zhǎng)進(jìn)行設(shè)計(jì)。

響應(yīng)面設(shè)計(jì)確定顯著影響因子的最佳值 以最陡爬坡的結(jié)果作為響應(yīng)面試驗(yàn)的中心點(diǎn)，利用軟件design expert 7.0 中的 Box－Behnken［12］設(shè)計(jì)功能得出試驗(yàn)程序，進(jìn)行試驗(yàn)，記錄結(jié)果。利用Box－Behnken中的方差分析功能分析試驗(yàn)結(jié)果，以確定顯著影響因子的最佳值。

3 結(jié)果與分析

3.1 Plackett－Burman設(shè)計(jì)篩選影響偶氮還原酶直接酶活的因子試驗(yàn)結(jié)果

對(duì)Plackett－Burman的結(jié)果進(jìn)行方差分析，以P值小于0.1為標(biāo)準(zhǔn)選擇3個(gè)顯著因子:pH、MgCl2、Na2HPO4，根據(jù)3個(gè)因子的效應(yīng)大小分別確定pH=5、MgCl2為 1.5 g·L－1、Na2HPO4為 8 g·L－1，作為最陡爬坡試驗(yàn)［11］的中心點(diǎn)，其他因子根據(jù)效應(yīng)大小取最大值或最小值。

3.2 最陡爬坡試驗(yàn)結(jié)果

采用Plackett－Burman法的1/4步長(zhǎng)進(jìn)行最陡爬坡試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果如表3所示。由表3可知，在6次試驗(yàn)中，第2次試驗(yàn)產(chǎn)生的偶氮還原酶酶活最高，故選其作為響應(yīng)面試驗(yàn)的中心點(diǎn)，即:MgCl2為1 g· L 、Na2HPO4為5 g·L 、pH值為6.0。

表2 Plackett－Burman試驗(yàn)結(jié)果

表3 最陡爬坡試驗(yàn)結(jié)果

3.3 響應(yīng)面設(shè)計(jì)確定顯著影響因子的最佳值

采用Box－Behnken設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)，其結(jié)果如表4所示。利用軟件design expert 7.0對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多元回歸擬合，得到二次多項(xiàng)回歸方程為:Y(直接酶活)=2.09+0.028A+0.10B+0.51C－0.22A2－0.12B2－0.20C2－0.14AB+0.053AC+0.059BC，其中 A代表MgCl2，B代表Na2HPO4，C代表pH。

表4 Box－Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

對(duì)回歸方程進(jìn)行方差分析，從響應(yīng)面試驗(yàn)方差分析結(jié)果(表5)可以看出:一次項(xiàng)C的影響非常顯著、B顯著;二次項(xiàng) A2、C2的影響非常顯著、AB顯著，其余項(xiàng)的影響不顯著，故模型高度顯著(P=0.0010＜0.050);回歸模型的決定系數(shù) R2=94.93%，表明其自變量與全體自變量之間的多元回歸關(guān)系顯著［14］;失擬項(xiàng)＞0.05，說(shuō)明該回歸方程具有較好的擬合度［15］，試驗(yàn)誤差小。因此，可以用該回歸方程對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行擬合分析和預(yù)測(cè)。

表5 響應(yīng)面試驗(yàn)方差分析結(jié)果

由表6可知，試驗(yàn)結(jié)果與預(yù)測(cè)相符，說(shuō)明響應(yīng)面分析法分析和預(yù)測(cè)偶氮還原酶直接酶活的值是可靠的。

表6 試驗(yàn)結(jié)果的驗(yàn)證

由圖1～圖6可以看出，Na2HPO4和MgCl2、pH和MgCl2、pH 和 Na2HPO4對(duì) Escherichia coli CD－2產(chǎn)偶氮還原酶酶活的交互作用都是顯著的，這可以通過(guò)3個(gè)橢圓形的等高線圖和另外3個(gè)較陡的立體曲面圖清楚地看出來(lái)。從3個(gè)立體曲面圖還可以看出，A、B和C都存在極值點(diǎn)。

圖1 Na2HPO4和MgCl2交互作用對(duì)直接酶活影響的響應(yīng)曲面圖

圖2 Na2HPO4和MgCl2交互作用對(duì)直接酶活影響的等高線圖

圖3 pH和MgCl2交互作用對(duì)直接酶活影響的響應(yīng)曲面圖

根據(jù)回歸方程求一階偏導(dǎo)得到Y(jié)的極大值，即在 MgCl2為 0.99 g·L－1、Na2HPO4為 6.00 g·L－1、pH=6.5時(shí)直接酶活達(dá)到最大，模型所預(yù)測(cè)的極大值酶活達(dá)到 2.451 U·mL－1。在 MgCl2為 0.99 g·L－1、Na2HPO4為 6.00 g·L－1、pH=6.5 條件下做 3次平行試驗(yàn)并取平均值，驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果。由表6可知，試驗(yàn)結(jié)果與預(yù)測(cè)相符，說(shuō)明用響應(yīng)面分析法分析和預(yù)測(cè)偶氮還原酶直接酶活的值是可靠的，從而確定了最佳培養(yǎng)基的組成為:甘露醇2 g·L－1、氯化銨3 g·L－1、接菌量 5%、pH=6.5、KH2PO42 g·L－1、Na2HPO46 g·L－1、MgCl20.99 g·L－1。優(yōu)化后的酶活達(dá)到 2.429 U·mL－1，是初始酶活的2.85 倍。

圖4 pH和MgCl2交互作用對(duì)直接酶活影響的等高線圖

圖5 pH和Na2HPO4交互作用對(duì)直接酶活影響的響應(yīng)曲面圖

圖6 pH和Na2HPO4交互作用對(duì)直接酶活影響的等高線圖

4 討論

E.coli CD－2是一株能夠降解偶氮染料、且在好氧條件下高效降解偶氮染料甲基紅的菌株。通過(guò)本次試驗(yàn)，偶氮還原酶酶活提高的幅度較大。抑制酶活進(jìn)一步提高的因子主要有空氣中的氧氣，它能將偶氮還原酶氧化。因此，可以在以后的試驗(yàn)中探索在粗酶液中添加抗氧化劑，如利用β－巰基乙醇來(lái)提高酶活。偶氮還原酶是胞內(nèi)酶，在一定條件下，每次能夠破碎細(xì)胞的數(shù)量一定。為了進(jìn)一步提高破胞數(shù)量，從而提高酶活，有必要在以后的試驗(yàn)中優(yōu)化破胞方法，如增加破胞次數(shù)、提高輸出功率、將超聲波破胞和低溫反復(fù)凍融交替進(jìn)行等方法。本試驗(yàn)中，響應(yīng)面優(yōu)化后酶活達(dá)到2.429 U·mL－1，比優(yōu)化前提高了2.85倍，證明響應(yīng)面分析法優(yōu)化得到的偶氮還原酶酶活培養(yǎng)基條件是有效的。最佳培養(yǎng)基組成:甘露醇 2 g·L－1、氯化銨 3 g·L－1、接菌量 5%、pH=6.5、KH2PO42 g·L－1、Na2HPO46 g·L－1、MgCl20.99 g·L－1。在最佳培養(yǎng)基條件下增強(qiáng)了 E.coli CD－2產(chǎn)偶氮還原酶的酶活，為今后應(yīng)用于污水處理奠定了基礎(chǔ)。

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