人肺癌細(xì)胞、組織中BRCA1蛋白的表達(dá)及與順鉑化療的相關(guān)性研究

王 紅* 秦海峰 王春楊 張金山

(1 解放軍307醫(yī)院肺部腫瘤科，北京100071；2 解放軍301醫(yī)院泌尿外科，北京100853；3 第四軍醫(yī)大學(xué)組織胚胎學(xué)教研室，陜西 西安710033）

乳腺癌相關(guān)蛋白有很多種，其中BRCA1是作重要的一種，源于腫瘤抑制基因之一（抑癌基因），且位于染色體17q21區(qū)域，它的功能和雙鏈DNA損傷后修復(fù)有關(guān)。BRCA1蛋白由N末端和C末端以及中間ATM，ATR的磷酸化區(qū)組成。如果有BRCA1基因突變的患者到40歲前其乳腺癌的患病風(fēng)險(xiǎn)比極高。許多研究已經(jīng)提示了其在散發(fā)型乳腺癌和卵巢癌中的重要作用[1]；很多證據(jù)證實(shí)BRCA1 在各種細(xì)胞活動(dòng)過(guò)程中參與以下功能：如DNA 修復(fù)，細(xì)胞周期，結(jié)節(jié)點(diǎn)阻滯，轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)和凋亡，和染色體重建[2-5]，但BRCA1在肺癌組織的分布及其作用近年鮮有報(bào)道，本文就是研究BRCA1蛋白在肺癌組織中的分布和特性以及是否與順鉑化療預(yù)后相關(guān)并進(jìn)行了討論。

1 材料與方法

1.1 材料、標(biāo)本和試劑

確診肺癌手術(shù)切除并經(jīng)病理組織學(xué)證實(shí)病例存檔石蠟包埋標(biāo)本60例。共60例肺癌標(biāo)本：其中來(lái)自解放軍307醫(yī)院病理科確診肺癌病例（經(jīng)病理學(xué)證實(shí)）的存檔石蠟包埋標(biāo)本15例（2001年1月至2008年1月），1995年1月至2000年12月西京醫(yī)院確診肺癌手術(shù)切除并經(jīng)病理組織學(xué)證實(shí)病例存檔石蠟包埋標(biāo)本10例，第四軍醫(yī)大學(xué)組胚教研室肺癌手術(shù)切除并經(jīng)病理組織學(xué)證實(shí)石蠟包埋存檔標(biāo)本35例。年齡29～75歲，平均55歲。

熒光顯微鏡（Olympus BX-60），小鼠抗人BRCA1單克隆抗體（CAlBIOCHEM），F(xiàn)ITC標(biāo)記的和Avidin-Texas red 標(biāo)記的二抗（山羊抗小鼠IgG，molecular probe公司），蘇木精和伊紅染色用試劑。

1.2 方法

1.2.1 組織切片制備

石蠟包埋肺癌組織切成5mm的方塊，經(jīng)甲醛固定后梯度脫水、浸蠟過(guò)夜高溫包埋。石蠟切片機(jī)進(jìn)行切片，成5～8μm石蠟切片，經(jīng)處理后準(zhǔn)備做抗體染色或HE染色。

1.2.2 細(xì)胞株的培養(yǎng)

人乳腺癌MCF-7和人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株NCI=H460 由實(shí)驗(yàn)室提供。于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，培養(yǎng)基為含10%胎牛血清的RPMI1640。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 免疫熒光雙重染色和免疫熒光顯微鏡觀察

細(xì)胞陽(yáng)性對(duì)照 無(wú)菌操作在潔凈臺(tái)下用鑷子放無(wú)菌的蓋玻片在6孔板中，消化后的MCF-7用DMEM培養(yǎng)液懸浮后到培養(yǎng)皿中，每個(gè)細(xì)胞數(shù)量106個(gè)，細(xì)胞貼壁后乙醇中固定10min，pH值適中0.01mmol/L PBS沖洗充分后與組織切片以血清封閉，充分浸潤(rùn)BRCA1第一抗體（稀釋比例1：100，molecular probes）4℃過(guò)夜。第二抗體Avidin-Texas red –山羊抗小鼠（稀釋比例1∶400，molecular probes）室溫浸潤(rùn)4h。0.01mmol/L PBS沖洗后以DAPI復(fù)染，甘油熒光封片劑封片待觀察計(jì)數(shù)。顯微鏡觀察時(shí)每個(gè)病例取5組切片，每張切片讀取10個(gè)高倍視野約400個(gè)腫瘤細(xì)胞。HE染色對(duì)照。

1.2.4 結(jié)果判定

BRCA1蛋白主要表達(dá)在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中；病例中BRCA1表達(dá)分布不均勻。有些以細(xì)胞核為主，BRCA1蛋白主要分布在細(xì)胞核和核膜；有些病例以細(xì)胞漿為主，存在于細(xì)胞漿；另外一些病例胞漿和胞核均有BRCA1分布。每例隨機(jī)觀察10個(gè)高倍視野約500個(gè)腫瘤細(xì)胞，均按照半定量積分法評(píng)分：陽(yáng)性細(xì)胞≤5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，≥75%為4分。染色強(qiáng)度：分為1、2、3分。細(xì)胞陽(yáng)性率與染色強(qiáng)度兩者積分相乘：0分為（-），1-4分為弱陽(yáng)性（+），5-8分為中度陽(yáng)性（++），9-12分為強(qiáng)陽(yáng)性（+++）。

1.2.5 臨床病例資料

共60例肺癌標(biāo)本：其中來(lái)自解放軍307醫(yī)院病理科確診肺癌病例（經(jīng)病理學(xué)證實(shí)）的存檔石蠟包埋標(biāo)本15例（2001年1月至2008年1月），1995年1月至2000年12月西京醫(yī)院確診肺癌手術(shù)切除并經(jīng)病理組織學(xué)證實(shí)病例存檔石蠟包埋標(biāo)本10例，第四軍醫(yī)大學(xué)組胚教研室肺癌手術(shù)切除并經(jīng)病理組織學(xué)證實(shí)石蠟包埋存檔標(biāo)本35例。年齡29～75歲，平均55歲。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)均采用 表示，采用SPSS 11.0軟件統(tǒng)計(jì)處理，Spearman相關(guān)分析與臨床特征的關(guān)系，檢驗(yàn)分析與預(yù)后因素的相關(guān)關(guān)系，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 BRCA1蛋白在人肺癌組織的表達(dá)和三種類型

免疫熒光染色實(shí)驗(yàn)和熒光顯微鏡的形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果證實(shí)肺癌組織存在BRCA1蛋白表達(dá)，全部60例肺癌組織中有42例（70%）標(biāo)本細(xì)胞表達(dá)BRCA1：且其中有24% BRCA1蛋白在細(xì)胞核分布，40.3%胞核、胞漿同時(shí)存在，35.7%只在胞漿中存在BRCA1蛋白（圖1和圖2）。

圖1 BRCA1陽(yáng)性病例中肺癌組織中BRCA1細(xì)胞分布類型

圖2 BRCA1蛋白在肺癌組織的分布(X100)

2.2 BRCA1蛋白表達(dá)及其分布在肺癌組織的核、漿比例不同（圖2）。BRCA1蛋白在一些病例有出核現(xiàn)象，BRCA1的組織分布有核漿比例改變：甚至有部分細(xì)胞BRCA1蛋白在細(xì)胞核沒(méi)有分布，僅在細(xì)胞漿可以觀察到BRCA1的分布，這樣的病例有15個(gè)包埋標(biāo)本，比例是35.7%（圖1）。對(duì)于50%以上肺癌患者的組織切片BRCA1蛋白在細(xì)胞核和漿分布比例均勻，BRCA1蛋白在細(xì)胞漿的細(xì)胞分布比例是31%～47%。

2.3 BRCA1蛋白低表達(dá)和高表達(dá)與順鉑化療的相關(guān)性分析

全部60例肺癌組織有70%的肺癌標(biāo)本細(xì)胞表達(dá)BRCA1：其中15個(gè)包埋標(biāo)本（35.7%）僅在細(xì)胞漿可以觀察到BRCA1的分布；另有17 包埋標(biāo)本（40.3%，其表達(dá)情況見(jiàn)圖1）細(xì)胞漿和細(xì)胞核均可觀察BRCA1表達(dá)，且有24% 包埋標(biāo)本中BRCA1蛋白在細(xì)胞核分布。結(jié)果判定按照以下標(biāo)準(zhǔn)：1～4分：弱陽(yáng)性（+），5～8分：中度陽(yáng)性（++），9～12分：強(qiáng)陽(yáng)性（+++）。

將全部BRCA1表達(dá)陽(yáng)性病例標(biāo)本回顧性分析與BRCA1低表達(dá)和高表達(dá)的結(jié)果（表1和表2）：BRCA1表達(dá)水平與性別、年齡、等（P=0.512、P=0.244、P=0.317）分層觀察無(wú)關(guān)，與PS評(píng)分呈正相關(guān)；BRCA1蛋白表達(dá)程度對(duì)含順鉑方案輔助化療的預(yù)后影響（P＜0.05）有顯著意義。40%（24 of 60）的患者有低中水平（弱陽(yáng)性、中等強(qiáng)度陽(yáng)性）表達(dá) BRCA1，30% （18 of 60）有高水平 BRCA1表達(dá)（強(qiáng)陽(yáng)性）（P=0.01）；低中表達(dá)水平BRCA1組的中位生存期為 120 月，高 BRCA1 水平的患者為34月（P＜0.05）?；仡櫺陨媛实膯我蛩胤治觯珺RCA1表達(dá)水平是獨(dú)立的預(yù)后因素。經(jīng)相關(guān)檢驗(yàn)，BRCA1蛋白表達(dá)與順鉑化療的預(yù)后呈負(fù)相關(guān)（P＜0.05）（表1和表2）。

表1 肺癌組織中BRCA1表達(dá)與肺癌臨床病理特征的相關(guān)性

表2 肺癌組織中BRCA1表達(dá)陽(yáng)性病例數(shù)與順鉑化療的相關(guān)性

3 討 論

近年來(lái)有關(guān)文章報(bào)道BRCA1在乳腺、卵巢腫瘤細(xì)胞的分布很明確[6,7]，并在DNA 修復(fù)，細(xì)胞周期，轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)和細(xì)胞凋亡等功能中有相應(yīng)的重要作用，但是關(guān)于BRCA1在肺腫瘤的分布和相關(guān)功能報(bào)道鮮為人知，本研究首次證實(shí)了BRCA1蛋白在人類肺癌細(xì)胞存在。

BRCA1蛋白功能的研究表明它是一種細(xì)胞核、細(xì)胞漿的出核互動(dòng)蛋白[8]。尤其是在乳腺腫瘤細(xì)胞、卵巢腫瘤細(xì)胞中照射后其出核現(xiàn)象和功能的討論有很多相關(guān)報(bào)道[9-10]。本研究結(jié)果明確表明肺癌的BRCA1蛋白表達(dá)也存在細(xì)胞核、細(xì)胞漿的互動(dòng)現(xiàn)象（圖1和圖2）；但和以往關(guān)于其他腫瘤的研究結(jié)果不同，BRCA1蛋白表達(dá)在細(xì)胞漿和細(xì)胞核同時(shí)存在的比例（40.3%）遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其僅在細(xì)胞核分布的比例（24%），這是否給予我們提示肺癌組織中BRCA1表達(dá)不僅僅是與DNA修復(fù)等細(xì)胞核功能相關(guān)，還參與細(xì)胞漿中腫瘤相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。

BRCA1蛋白 低表達(dá)和高表達(dá)與順鉑化療的相關(guān)性分析：本研究重點(diǎn)是發(fā)現(xiàn)了肺癌組織的BRCA1蛋白表達(dá)（圖1和圖2），但發(fā)生BRCA1蛋白的核漿比例改變?cè)诜伟┙M織很特殊，并且與腫瘤發(fā)生發(fā)展機(jī)制和功能可能有密切關(guān)系。本研究還發(fā)現(xiàn)，低中表達(dá)水平BRCA1組的中位生存期為 120個(gè)月，高表達(dá) BRCA1 水平的患者為34個(gè)月（P＜0.05）?；仡櫺陨媛实膯我蛩胤治?，BRCA1表達(dá)水平是獨(dú)立的預(yù)后因素。經(jīng)相關(guān)檢驗(yàn)，BRCA1蛋白表達(dá)與經(jīng)順鉑輔助化療的患者預(yù)后呈負(fù)相關(guān)（P＜0.05）（表1和表2）。有一點(diǎn)值得注意的是：高表達(dá) BRCA1水平的包埋標(biāo)本中BRCA1往往在細(xì)胞核中分布。這就提示BRCA1在細(xì)胞核中強(qiáng)陽(yáng)性分布可能是參與DNA修復(fù)而保護(hù)了細(xì)胞，而在細(xì)胞漿分布、低中水平陽(yáng)性分析與BRCA1參與細(xì)胞凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程有關(guān)，細(xì)胞對(duì)順鉑更敏感。這就給臨床上檢測(cè)BRCA1表達(dá)水平提供了強(qiáng)有力的實(shí)驗(yàn)室證據(jù)，如果提前預(yù)知對(duì)鉑類輔助化療的敏感性相關(guān)因素，進(jìn)而能夠通過(guò)化療延長(zhǎng)肺部腫瘤患者的生存，無(wú)疑是對(duì)臨床的指導(dǎo)意義令人激動(dòng)人心，原因是肺癌是全世界癌癥相關(guān)死亡的最主要原因[11]，肺癌病例中大約85%～90%為非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）。

綜上所述，我們得出以下結(jié)論：①BRCA1蛋白肺癌組織細(xì)胞表達(dá)，其正常分布比例為細(xì)胞核占24%，細(xì)胞核與漿占40.3%，細(xì)胞漿占35.7%。② 其漿核分布有特點(diǎn)，即BRCA1在肺癌組織有蛋白出核現(xiàn)象。這就進(jìn)一步提示BRCA1可能具有與肺癌的發(fā)生相關(guān)的蛋白特性。③BRCA1在 DNA 修復(fù)通路中的核心作用，低 BRCA1 表達(dá)與對(duì) 順伯敏感相關(guān)，提示延長(zhǎng)肺癌患者生存的新思路。

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