抗體介導(dǎo)的排斥反應(yīng)病理學(xué)研究概要

郭暉

隨著細(xì)胞性排斥反應(yīng)的有效控制和抗體介導(dǎo)的排斥反應(yīng)(antibody-mediated rejection，AMR)發(fā)病機(jī)制及其各移植器官病理學(xué)特征研究的深入，AMR已經(jīng)成為排斥反應(yīng)預(yù)防、診斷和治療的核心內(nèi)容。進(jìn)一步了解AMR的病理學(xué)特征及其研究進(jìn)展，有助于移植病理醫(yī)師更好地利用其病理學(xué)特點(diǎn)及時(shí)準(zhǔn)確地判斷并指導(dǎo)臨床治療，切實(shí)改善移植受者和移植器官的長(zhǎng)期存活。

1 有關(guān)AMR認(rèn)識(shí)的簡(jiǎn)要回顧

AMR亦稱體液性排斥反應(yīng)(humoral rejection)，其中參與的體液性因素主要為移植后產(chǎn)生的供者特異性抗體(donor-specific antibody，DSA)，亦稱為受者同種反應(yīng)性抗體(recipientde novoalloantibody或de novoDSA)。1970 年 Jeannet等［1］提出腎移植受者術(shù)后早期即會(huì)產(chǎn)生DSA，其可以導(dǎo)致嚴(yán)重的血管性排斥反應(yīng)，這類受者預(yù)后很差［2-4］。隨后在20世紀(jì)90年代早期，加拿大 Alberta大學(xué)的 Halloran等［5-8］明確了在移植腎急性排斥反應(yīng)時(shí)伴有抗HLA的de novoDSA產(chǎn)生，并初步提出了抗體所致免疫損傷的途徑為“補(bǔ)體-中性粒細(xì)胞途徑(complementneutrophil pathway)”，即DSA與移植物HLA抗原結(jié)合后激活補(bǔ)體，介導(dǎo)炎癥細(xì)胞反應(yīng)導(dǎo)致局部組織免疫性損傷。幾乎與此同時(shí)，1993年德國(guó)慕尼黑大學(xué)的Feucht等［9-10］最早報(bào)道了移植物毛細(xì)血管內(nèi)皮表面補(bǔ)體片段C4d沉積與移植物失功能的關(guān)系以及可以作為AMR的組織學(xué)指標(biāo)。這一發(fā)現(xiàn)幾乎可以稱為器官移植排斥反應(yīng)研究尤其是AMR研究的一次“革命”。在此基礎(chǔ)上，美國(guó)麻省總醫(yī)院的Collins等［11］在移植腎活組織檢查(以下簡(jiǎn)稱“活檢”)C4d免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)及其臨床-病理關(guān)系方面進(jìn)行了深入的研究，規(guī)范性地建立了C4d免疫熒光以及免疫酶染色檢測(cè)方法。隨后瑞士巴塞爾大學(xué)病理學(xué)研究所也確定了將C4d染色作為臨床移植腎AMR特異的診斷標(biāo)志物。緊接著，維也納大學(xué)的B?hmig等［12-13］通過(guò)研究進(jìn)一步證實(shí)了上述發(fā)現(xiàn)。這一系列研究進(jìn)展，不僅迅速改變了長(zhǎng)期以來(lái)單純以細(xì)胞免疫作為移植物排斥反應(yīng)損傷效應(yīng)機(jī)制的觀念，而且也打破了長(zhǎng)期以來(lái)由于缺乏一種特異性診斷標(biāo)志物從而使得AMR免疫損傷機(jī)制的研究一直裹足不前的局面。

2 AMR的分類及其診斷

C4d指標(biāo)在AMR中診斷意義的明確及其檢測(cè)方法的建立，不僅揭示了體液免疫反應(yīng)的存在，而且也幫助我們認(rèn)識(shí)到:AMR的靶部位主要位于以移植物毛細(xì)血管為主的末梢血管床，進(jìn)而造成廣泛的血管內(nèi)皮免疫損傷，并可以成為慢性移植物血管病或慢性移植物失功能的重要致病因素之一。AMR參與到幾乎所有排斥反應(yīng)類型的病理?yè)p傷機(jī)制中(見圖1)，包括經(jīng)典排斥反應(yīng)類型中的超急性排斥反應(yīng)和急性排斥反應(yīng)，甚至慢性排斥反應(yīng)，在這個(gè)認(rèn)識(shí)基礎(chǔ)上提出的慢性AMR的概念逐漸被大家所接受。

圖1 抗體介導(dǎo)的排斥反應(yīng)與超急性排斥反應(yīng)、急性排斥反應(yīng)以及慢性排斥反應(yīng)的關(guān)系模式圖

在上述經(jīng)典分類的基礎(chǔ)上，隨著AMR的臨床、病理學(xué)以及免疫學(xué)綜合研究的深入，其基本的臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)逐漸明確，即應(yīng)包括是否出現(xiàn)移植物功能減退、能否在受者血清內(nèi)檢測(cè)出DSA、移植物活檢組織內(nèi)是否具有相應(yīng)的組織學(xué)改變以及是否具有C4d染色陽(yáng)性。在2003年4月，由美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院(National Institute of Health)組織了由病理學(xué)家、臨床學(xué)家以及基礎(chǔ)研究科學(xué)家組成的國(guó)際專家組，針對(duì)AMR的移植術(shù)前檢測(cè)的技術(shù)與方法、臨床綜合診斷(包括臨床表現(xiàn)、病理學(xué)與免疫學(xué))指標(biāo)、臨床治療以及基礎(chǔ)研究進(jìn)行了分組研討，初步提出了一種新的AMR的類型劃分［14］，見表1。

表1 2003年美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院制訂的AMR分類a

因此，嚴(yán)格而言，建立AMR的診斷應(yīng)具備兩方面的資料，即在移植者血清內(nèi)檢測(cè)出DSA以及在移植物內(nèi)檢測(cè)出AMR的標(biāo)志物C4d。此外，嚴(yán)重者可有臨床移植物功能異常。AMR基本的臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)如下:(1)臨床可見明顯的移植物功能減退;(2)組織學(xué)檢查見毛細(xì)血管內(nèi)中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞等的淤積;(3)C4d免疫組織化學(xué)法染色見毛細(xì)血管或腎小管管周毛細(xì)血管部位C4d陽(yáng)性表達(dá);(4)對(duì)激素等常規(guī)抗排斥反應(yīng)治療無(wú)效。

3 AMR基本病理學(xué)特征

移植物最嚴(yán)重的AMR無(wú)疑是臨床超急性排斥反應(yīng)，其主要的病理學(xué)特征為動(dòng)脈管壁纖維素樣壞死，廣泛的血管腔內(nèi)血栓形成，移植物缺血性或出血性壞死(見圖2)，甚至可致移植腎破裂，移植物間質(zhì)內(nèi)明顯出血、水腫以及大量中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)。

移植腎急性AMR時(shí)病理學(xué)表現(xiàn)包括嚴(yán)重的血管內(nèi)膜炎、動(dòng)脈血管管壁纖維素樣壞死、腎小球炎、腎小管管周毛細(xì)血管內(nèi)中性粒細(xì)胞淤積、實(shí)質(zhì)組織梗死等。也有研究者報(bào)道腎小球毛細(xì)血管叢和(或)腎小管管周毛細(xì)血管內(nèi)單核/巨噬細(xì)胞的出現(xiàn)是AMR的早期標(biāo)志。

圖2 移植腎抗體介導(dǎo)的排斥反應(yīng)(超急性排斥反應(yīng))大體標(biāo)本

移植肝AMR的組織學(xué)表現(xiàn)因是否ABO血型不相合肝移植以及活檢取材或移植肝切取的時(shí)間而有所不同。對(duì)于ABO血型不合肝移植受者，肉眼可見移植肝明顯腫大并呈現(xiàn)出血狀外觀;鏡下可見大片出血性或缺血性壞死灶，各級(jí)動(dòng)脈以及靜脈血管分支呈血管內(nèi)膜炎，血管內(nèi)皮細(xì)胞明顯水腫，管壁呈纖維素樣壞死。術(shù)后即刻活檢可見肝竇內(nèi)紅細(xì)胞以及中性粒細(xì)胞淤積;匯管區(qū)靜脈分支和(或)中央靜脈管腔內(nèi)纖維素樣血栓栓塞;肝小葉內(nèi)小灶狀肝細(xì)胞缺血壞死。數(shù)天后活檢可見肝組織內(nèi)肝細(xì)胞缺血性壞死更為明顯，部分肝組織出血性壞死;血管內(nèi)皮細(xì)胞明顯水腫以及腔內(nèi)血栓形成。對(duì)于ABO血型相合的肝移植受者如果發(fā)生AMR，一般其程度較之ABO血型不相合移植受者輕，主要表現(xiàn)為肝動(dòng)脈以及門靜脈血管分支血管內(nèi)膜炎，肝細(xì)胞可以出現(xiàn)點(diǎn)狀嗜酸性壞死或小灶狀缺血性壞死。國(guó)際推薦的基本診斷標(biāo)準(zhǔn)為:移植肝出現(xiàn)快速肝功能下降，組織學(xué)檢查可見肝組織缺血性壞死并伴有中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)并排除了其他可能導(dǎo)致移植肝缺血性壞死的原因。如果在排除了血管并發(fā)癥所致梗死等因素后，對(duì)于肝組織內(nèi)壞死性動(dòng)脈炎、免疫球蛋白沉積以及在移植受者血清內(nèi)檢測(cè)出DSA，則建議可以直接診斷AMR。AMR有時(shí)難以與其他導(dǎo)致移植肝損傷的并發(fā)癥如嚴(yán)重的缺血再灌注損傷以及血管栓塞等相鑒別，在借助影像學(xué)檢查等排除了血管并發(fā)癥以及在活檢組織內(nèi)發(fā)現(xiàn)明顯的血管內(nèi)膜炎等組織學(xué)表現(xiàn)后，這一鑒別過(guò)程則相對(duì)比較容易了。

移植心臟的AMR最主要的特征為冠狀動(dòng)脈血管分支的動(dòng)脈內(nèi)膜炎甚至壞死性動(dòng)脈炎。在移植肺，除血管內(nèi)皮細(xì)胞作為主要靶部位形成移植肺動(dòng)脈內(nèi)膜炎外，移植肺各級(jí)支氣管黏膜上皮(airway epithelial cell)由于強(qiáng)烈表達(dá)HLAⅡ 類抗原分子，因此也成為AMR攻擊的主要靶部位，甚至有部分研究者報(bào)道了移植肺支氣管黏膜上皮細(xì)胞較之血管內(nèi)皮細(xì)胞在排斥反應(yīng)中具有更重要的作用。

目前，隨著C4d這一補(bǔ)體片段在AMR診斷中的研究越來(lái)越廣泛，各種移植物C4d免疫組織化學(xué)染色的表現(xiàn)日益明了。C4d免疫組織化學(xué)染色已經(jīng)成為移植腎必要的檢測(cè)項(xiàng)目，而且在移植肝、心臟、肺等多種移植物AMR中的作用正在逐漸被認(rèn)識(shí)。移植腎發(fā)生AMR時(shí)，免疫熒光以及免疫酶染色可見腎組織內(nèi)廣泛的腎小管管周毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞以及基底膜有線樣C4d陽(yáng)性表達(dá)(見圖3);在移植肝組織內(nèi)可見肝竇內(nèi)皮細(xì)胞或匯管區(qū)C4d陽(yáng)性表達(dá)(見圖4);在移植心臟的心肌間毛細(xì)血管基底膜有C4d陽(yáng)性表達(dá)(見圖5);在移植肺，可見C4d表達(dá)于終末細(xì)支氣管黏膜上皮細(xì)胞表面，甚至在移植肺慢性排斥反應(yīng)即閉塞性支氣管炎時(shí)，仍可見終末細(xì)支氣管黏膜上皮細(xì)胞表面C4d陽(yáng)性表達(dá)。

圖3 移植腎抗體介導(dǎo)的排斥反應(yīng)組織病理學(xué)表現(xiàn)(免疫酶染色 ×400)

慢性AMR病理學(xué)特征與慢性細(xì)胞性排斥反應(yīng)相似。慢性AMR在移植腎除主要表現(xiàn)為移植腎動(dòng)脈血管病外，近來(lái)研究發(fā)現(xiàn)移植腎腎小球病(transplant glomerulopathy)是慢性AMR的新的特征性病變［15］，主要表現(xiàn)為移植腎腎小球系膜基質(zhì)增生、硬化分葉和毛細(xì)血管基底膜雙軌樣改變，但缺乏電子致密物沉積。移植肝慢性AMR則同樣表現(xiàn)為慢性移植肝動(dòng)脈血管病和膽管缺失;移植心臟表現(xiàn)為移植心臟冠狀動(dòng)脈血管病。其確診除具備以移植物動(dòng)脈血管病為主要特點(diǎn)的病變外，還須經(jīng)移植物免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)到C4d表達(dá)和受者血清檢測(cè)出DSA證實(shí)。

圖4 移植肝抗體介導(dǎo)的排斥反應(yīng)組織病理學(xué)表現(xiàn)(免疫酶染色 ×200)

圖5 移植心臟抗體介導(dǎo)的排斥反應(yīng)組織病理學(xué)表現(xiàn)(免疫酶染色 ×200)

4 AMR病理學(xué)研究進(jìn)展

4.1 關(guān)于C4d陰性AMR

隨著C4d免疫組織化學(xué)染色在移植物活檢診斷中的應(yīng)用日益廣泛，目前發(fā)現(xiàn)C4d在診斷AMR上具有局限性［16］。部分病例移植物活檢具備AMR的病理學(xué)特征且受者血清中檢測(cè)到DSA而C4d檢測(cè)呈陰性，僅能疑為AMR或診斷為C4d陰性AMR，尤其是許多慢性移植腎腎小球病受者體內(nèi)可檢測(cè)到DSA但活檢組織內(nèi)C4d染色呈陰性。這或許是由于染色方法學(xué)的原因，或許是由于石蠟制片過(guò)程溶解了內(nèi)皮細(xì)胞上沉積的補(bǔ)體，抑或由于抗體與移植抗原結(jié)合后尚未充分結(jié)合補(bǔ)體等因素，也可以由于抗HLAⅡ類抗原抗體介導(dǎo)的移植物血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡而無(wú)需激活外體(非補(bǔ)體依賴性的途徑)等。此外C4d表達(dá)也可見于ABO血型不合移植術(shù)后應(yīng)用eculizumab治療且未出現(xiàn)間質(zhì)-腎小管病變和無(wú)移植物功能減退的病例中。可見C4d對(duì)AMR的診斷具有較好的特異性，但敏感性并不高，C4d陰性者并不能絕對(duì)排除AMR的診斷。由于C4d免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)在C4d陰性AMR診斷中失去了意義，借助NK細(xì)胞檢測(cè)和電鏡觀察血管內(nèi)皮是否活化和損傷以及檢測(cè)免疫損傷所致血管內(nèi)皮活化相關(guān)標(biāo)志物均有助于明確C4d陰性AMR患者診斷和預(yù)后。Sis等［17］近來(lái)報(bào)道，通過(guò)篩查C4d陰性和C4d陽(yáng)性受者移植腎活檢組織內(nèi)血管內(nèi)皮活化相關(guān)因子，發(fā)現(xiàn)其中馮·維勒布蘭德(von Willebrand's)因子(vWF)、小凹蛋白1(caveolin-1)、黑色素瘤細(xì)胞粘附分子(melanoma cell adhesion molecule)、血小板/內(nèi)皮粘附分子(platelet/endothelial cell adhesion molecule-1)、選擇素-1(selectin-1)、CD34和鈣粘素-5與 AMR顯著相關(guān)，其對(duì)于 C4d陰性DSA陰性AMR診斷的敏感性和特異性分別為77%和71%，同時(shí)可與T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的排斥反應(yīng)和其他非免疫因素?fù)p傷較好鑒別。

4.2 移植肝AMR

移植肝AMR中C4d染色的病理學(xué)特征一直存在爭(zhēng)議［18］。我們觀察了移植肝活檢組織中AMR特異性標(biāo)志物C4d的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)其陽(yáng)性率僅4.5%，遠(yuǎn)低于移植腎活檢組織中約15%的陽(yáng)性率;且移植肝AMR患者C4d陽(yáng)性表達(dá)僅有極少許在肝竇內(nèi)皮和少數(shù)在匯管區(qū)內(nèi)纖維組織，難以見到在肝竇內(nèi)皮彌漫性表達(dá);在慢性排斥反應(yīng)病例中均未檢出C4d沉積［19］，造成這一現(xiàn)象的機(jī)制有待后續(xù)研究。目前推測(cè)可能與以下因素有關(guān):(1)肝血竇類似于一塊巨大“海綿”吸附受者體內(nèi)的預(yù)存抗體或抗原-抗體復(fù)合物，阻止其作用于內(nèi)皮細(xì)胞;(2)肝具有動(dòng)脈和門靜脈的雙重血供，且肝竇由不連續(xù)的或網(wǎng)狀的內(nèi)皮細(xì)胞覆蓋這一獨(dú)特的解剖結(jié)構(gòu)，更容易耐受補(bǔ)體激活形成的微血栓和缺血損傷;(3)肝竇內(nèi)皮大量庫(kù)普弗(Kupffer)細(xì)胞具有強(qiáng)大的吞噬和清除免疫復(fù)合物的能力等，因此移植肝可能與移植腎、心臟等具有完全不同的免疫耐受機(jī)制。

Neil等［20］最新研究發(fā)現(xiàn)移植肝急性排斥反應(yīng)是其慢性排斥反應(yīng)直接始動(dòng)因素，而且急性排斥反應(yīng)后發(fā)生慢性排斥反應(yīng)非常迅速(3個(gè)月左右)。在組織學(xué)上貫穿于慢性排斥反應(yīng)的演進(jìn)過(guò)程中的最關(guān)鍵的表現(xiàn)為肝小葉中央靜脈血管內(nèi)皮炎以及以它為中心的小葉中央壞死性炎癥(centrilobular necroinflammation，CLNI)和小葉中央肝細(xì)胞壞死(centrilobular necrosis)，這一研究再次證明肝小葉的壞死性炎癥在進(jìn)展為慢性排斥反應(yīng)中的重要性。同時(shí)，CLNI在急性排斥反應(yīng)診斷中的價(jià)值也有提高:若移植肝活檢組織中有CLNI而沒(méi)有或僅有輕微的炎性浸潤(rùn)時(shí)也可判斷為急性排斥反應(yīng)。通過(guò)增加免疫抑制劑的用量可使急性排斥反應(yīng)組織學(xué)特征之一——匯管區(qū)炎性浸潤(rùn)消失，但CLNI卻仍然存在，提示需要延長(zhǎng)免疫抑制劑沖擊治療的時(shí)間或存在其他的目前尚未明了的致病機(jī)制。由于Nakazawa等［21］的研究也有類似發(fā)現(xiàn)，因而最近的移植肝活檢診斷與分級(jí)的Banff標(biāo)準(zhǔn)中將CLNI增補(bǔ)為急性排斥反應(yīng)的診斷依據(jù)，并且認(rèn)為以前的名稱“中央靜脈炎(central venulitis)”并不恰當(dāng)，而“小葉中央壞死性炎癥(centrilobular necroinflammation)”的名稱更為準(zhǔn)確。進(jìn)一步的研究還發(fā)現(xiàn)，CLNI可進(jìn)展為小葉中央纖維化(centrilobular fibrosis)，形成肝小葉第3區(qū)肝組織纖維化，并成為移植肝向慢性排斥反應(yīng)進(jìn)展的重要指征。

4.3 移植心臟AMR

近來(lái)逐漸明確AMR不僅導(dǎo)致移植后近期移植心臟失功能，而且也是導(dǎo)致移植心臟發(fā)生以冠狀動(dòng)脈血管病為特征的慢性排斥反應(yīng)的重要危險(xiǎn)因素［22］。國(guó)際上多數(shù)心臟移植中心確定在移植心臟內(nèi)膜心肌活檢組織內(nèi)IgG、IgM、IgA、C1q、C3d和C4d是AMR的病理組織學(xué)標(biāo)志物，其中C4d作為活化的補(bǔ)體片段，是活檢診斷中新的、優(yōu)于上述其他指標(biāo)的、更為特異的診斷AMR的免疫病理學(xué)指標(biāo)。基于C4d免疫組織化學(xué)染色技術(shù)，Michaels等［23］報(bào)道移植心臟AMR的發(fā)生率為44%～59%。我們應(yīng)用光鏡和C4d免疫酶染色方法觀察移植心臟內(nèi)膜心肌活檢組織，發(fā)現(xiàn)移植心臟呈C4d陽(yáng)性的AMR是移植術(shù)后常見的并發(fā)癥之一，其發(fā)生率為43.7%［24］。

移植心臟AMR是否導(dǎo)致臨床癥狀和體征一直存有疑問(wèn)。部分發(fā)生移植心臟AMR患者僅出現(xiàn)低熱、乏力、輕微氣短和運(yùn)動(dòng)后呼吸困難，胸部X線攝片檢查無(wú)異常、心電圖QRS波群電壓輕微下降，甚至無(wú)任何癥狀和體征，而移植心臟內(nèi)膜心肌活檢后C4d免疫組織化學(xué)染色呈陽(yáng)性。我們認(rèn)為該部分患者屬于所謂“亞臨床AMR”。這一結(jié)果提示移植心臟內(nèi)膜心肌活檢病理學(xué)診斷仍是鑒別細(xì)胞性排斥反應(yīng)和AMR以及其它并發(fā)癥的獨(dú)特手段，是其他診斷手段所不能取代的。

因AMR也是導(dǎo)致移植心臟慢性排斥反應(yīng)的重要致病因素之一，故早期診斷和及時(shí)治療移植心臟AMR成為預(yù)防移植心臟慢性排斥反應(yīng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。移植心臟內(nèi)膜心肌活檢組織C4d免疫酶染色是更切合臨床診斷實(shí)際，具有良好時(shí)效性、特異性和敏感性的方法。近來(lái)Rodriguez等［25］報(bào)道在結(jié)合臨床檢查同時(shí)聯(lián)合進(jìn)行C4d和C3d染色能提高移植心臟AMR診斷的敏感性，可更好地指導(dǎo)治療和預(yù)防慢性排斥反應(yīng)的發(fā)生。

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