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    齊墩果酸對抗小鼠胰島細(xì)胞糖脂毒性和凋亡促進(jìn)胰島素分泌

    2012-09-15 08:00:04程路峰張東輝毛新民李學(xué)軍
    基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床 2012年11期
    關(guān)鍵詞:齊墩低糖糖脂

    張?之,程路峰,張東輝,張 燕,毛新民,李學(xué)軍

    (1.新疆醫(yī)科大學(xué)?基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理教研室;2.新疆醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院;3.蘭州軍區(qū)烏魯木齊總醫(yī)院,新疆烏魯木齊830011;4.北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部,北京100191)

    齊墩果酸(Oleanolic acid,OA)是一種五環(huán)三萜類化合物,臨床上用為保肝藥,是女貞子、石榴等許多中藥的活性成分之一。近年來研究發(fā)現(xiàn)OA具有改善糖耐量、保護(hù)糖尿病腎臟、激動PPARγ,激活酪氨酸磷酸酶Shp2等作用,可能是一個有潛力的抗糖尿病的天然物質(zhì)[1-5],齊墩果酸降糖作用可能與其能促進(jìn)胰島素分泌有關(guān)[6]。但對其在長期糖脂毒狀態(tài)下對胰島細(xì)胞的作用未見報道。本實驗觀察了OA在高糖脂毒環(huán)境下對原代培養(yǎng)胰島細(xì)胞分泌功能的影響,并從其對胰島細(xì)胞增殖與凋亡的影響探討其可能的機制。

    1 材料與方法

    1.1 藥品與試劑

    齊墩果酸、雙硫棕、臺盼藍(lán)、噻唑藍(lán)(MTT)和胰蛋白酶(Sigma公司);Annexin-FITC/PI雙染試劑盒(Invetrogene公司);胰島素放射免疫分析試劑盒(北京北方生物技術(shù)研究所);DMEM完全培養(yǎng)液和胎牛血清(Gibco公司);格列苯脲(Glibenclamide,天津太平洋制藥公司),棕櫚酸(palmitic acid,PA),碘乙酸均為CP級。

    1.2 小鼠原代胰島細(xì)胞培養(yǎng)

    參照參考文獻(xiàn)[7]等方法,經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定、活力及生物學(xué)功能鑒定合格后,備用。

    1.3 胰島素分泌功能測定

    將胰島細(xì)胞數(shù)調(diào)整為2×105~5×105個/mL,每孔加胰島細(xì)胞懸液1.0 mL,接種于24孔培養(yǎng)板中,分別加入低糖(5.6 mmol/L葡萄糖),高糖脂(30 mmol/L葡萄糖+0.5 mmol/L棕櫚酸),高糖脂+陽性對照格列苯脲(25 mg/L),高糖脂+不同濃度OA(5、10和20 mg/L)進(jìn)行培養(yǎng),每組4復(fù)孔,2和5 d后吸取培養(yǎng)液上清,用放射免疫法測定胰島素含量。

    1.4 胰島細(xì)胞增殖活力測定

    培養(yǎng)良好的胰島細(xì)胞用胰蛋白酶消化成含2×104~5×104個/mL的單細(xì)胞懸液,接種于96孔培養(yǎng)板中,低糖、高糖脂及藥物不同濃度干預(yù)組每組各設(shè)5復(fù)孔,并設(shè)不含細(xì)胞只含培養(yǎng)液的空白調(diào)零孔,37℃,5%CO2,飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2和5 d后,每孔加入20 μL 5 g/L的MTT溶液繼續(xù)培養(yǎng)4 h,吸出培養(yǎng)后加入200 μL二甲基亞砜,使結(jié)晶物溶解均勻,酶標(biāo)儀490 nm處測定吸光度。

    1.5 胰島細(xì)胞凋亡測定

    將生長良好的胰島細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板中,分別加低糖、高糖脂及藥物+高糖脂培養(yǎng)基2 mL,每組設(shè)3個復(fù)孔,干預(yù)6 d后收集細(xì)胞,冷PBS洗,洗后細(xì)胞再離心,棄上清重懸細(xì)胞用1×Annexin-binding緩沖液稀釋至1×106個/mL,加入AV,PI室溫避光孵育15 min,樣品置冰上盡快用流式細(xì)胞儀530 nm檢測熒光發(fā)射。

    1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

    SPSS13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析,計量數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,AVON單因素方差分析后進(jìn)行多組間均數(shù)比較。

    2 結(jié)果

    2.1 齊墩果酸對高糖脂培養(yǎng)胰島細(xì)胞胰島素分泌的作用

    高糖脂培養(yǎng)2 d胰島素分泌降低,5 d時顯著低于正常低糖培養(yǎng)組(P<0.01),5 mg/L OA干預(yù)2 d胰島素分泌明顯高于高糖脂組,20 mg/L OA干預(yù)組在第5天胰島素分泌顯著高于高糖脂組(P<0.05)(表1)。

    表1 OA對高糖脂培養(yǎng)胰島細(xì)胞insulin分泌功能的影響Table 1 Effects of OA on insulin secretion of islet cell under glucose and fat cultivation(x ± s,n=4)

    2.2 齊墩果酸對高糖脂培養(yǎng)胰島細(xì)胞增殖活力的影響

    高糖脂培養(yǎng)2 d胰島細(xì)胞增殖與低糖培養(yǎng)組比較沒有顯著差異,而第5天高糖脂毒對胰島細(xì)胞活力的抑制作用明顯,第5天時,5和10 mg/L OA藥物干預(yù)組及陽性對照組細(xì)胞增殖作用顯著高于高糖脂組(P<0.05)(表2)。

    2.3 齊墩果酸對高糖脂培養(yǎng)胰島細(xì)胞凋亡的影響

    原代胰島細(xì)胞正常低糖培養(yǎng)基培養(yǎng)6 d,細(xì)胞凋亡率為3.9%,高糖脂聯(lián)合培養(yǎng)組細(xì)胞凋亡率為15.1%,10 mg/L齊墩果酸干預(yù)組胰島細(xì)胞凋亡率為7.4%,凋亡率顯著降低(圖1)。

    3 討論

    近年來糖尿病治療從關(guān)注胰島素外周靶器官轉(zhuǎn)變到更關(guān)注胰島本身,英國糖尿病聯(lián)盟[8]前瞻性研究顯示,糖尿病患者胰島素分泌功能隨病程進(jìn)展進(jìn)行性下降,直至耗竭,絕大多數(shù)患者不得不依靠外源性胰島素控制血糖,因此提出保護(hù)胰島細(xì)胞功能,抑制胰島細(xì)胞凋亡對延緩糖尿病進(jìn)展有重要意義。

    表2 OA對高糖脂培養(yǎng)胰島細(xì)胞活力的影響Table 2 Effect of OA on islet cell viability under glucolipotoxicity(x ± s,n=5)

    圖1 低糖、高糖脂、高糖脂+OA分別培養(yǎng)6 d對原代培養(yǎng)胰島細(xì)胞凋亡的影響Fig 1 Apoptosis of primary cultured islet cell under low level glucose,high glucolipo,high glucolipo+OA culture respectively

    高糖脂毒性能抑制胰島素胞吐環(huán)節(jié),引起胰島素含量衰竭,胰島素前體分子增加,進(jìn)行性DNA片斷增加以及暫時的β細(xì)胞增殖反應(yīng)等,毒性機制涉及胰十二指腸同源盒因子-1(PDX-1)及肌腱膜纖維肉瘤癌基因同源核A(MafA)結(jié)合活性的降低,基因表達(dá)的抑制等[9]。本研究顯示高糖脂培養(yǎng)初期對胰島細(xì)胞增殖活力影響不明顯,但對胰島素分泌抑制作用已經(jīng)顯著并且隨時間推移持續(xù)增強,甚至耗竭。天然多酚齊墩果酸有一定對抗糖脂毒性促胰島素分泌作用,小劑量(5 mg/L)OA促胰島素分泌作用強,但短暫,作用特點類似25 mg/L格列本脲,而稍大劑量OA(20 mg/L)作用平緩持久,原因有待進(jìn)一步研究。

    高糖脂毒性能抑制細(xì)胞增殖加速胰島細(xì)胞凋亡[10],內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、線粒體DNA損傷等參與了凋亡過程[11-12],本實驗發(fā)現(xiàn)OA具有一定有促進(jìn)胰島細(xì)胞增殖,對抗糖脂毒誘導(dǎo)的胰島細(xì)胞凋亡作用,這可能是其保護(hù)胰島細(xì)胞的機制之一。有趣的是OA及格列本脲促細(xì)胞增殖與促胰島素分泌效果的顯現(xiàn)時間上呈不同步現(xiàn)象,推測胰島素分泌匱乏時可能會代償性的促進(jìn)胰島細(xì)胞增殖,胰島素分泌及細(xì)胞增殖過程周期不同不是呈直線式而是有峰谷現(xiàn)象造成,OA抗凋亡作用的具體分子機制有待進(jìn)一步研究。

    本實驗前期研究顯示,石榴皮乙酸乙酯提取物有對抗高糖脂毒促進(jìn)胰島素分泌的作用,而齊墩果酸、鞣花酸及沒食子酸等是該提取物主要成分,本實驗進(jìn)一步表明齊墩果酸具有一定抗糖脂毒促胰島素分泌作用,但依賴于合適的濃度及作用時間,齊墩果酸抗凋亡的機制靶點及其與其他多酚類是否存在協(xié)同作用等都是進(jìn)一步研究的方向。

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