北柴胡幼根、子葉和下胚軸組織培養(yǎng)研究

徐麗霞

（山西藥科職業(yè)學(xué)院中藥系，山西太原030031）

北柴胡為傘型科多年生草本植物，主要以根入藥，具有和解退熱、舒肝解郁、升舉陽氣之功能。且柴胡為四季常用藥，在中成藥片劑、針劑、口服液等生產(chǎn)領(lǐng)域應(yīng)用廣泛，需求量大[1]。然而，柴胡的野生資源逐年減少，人工種植存在種子發(fā)芽率低，栽培技術(shù)難度大等問題[2]。因而，應(yīng)用組織培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行優(yōu)質(zhì)柴胡植株培育并批量生產(chǎn)和供應(yīng)市場是目前亟待解決的問題。

近年來，柴胡組織細(xì)胞培養(yǎng)方面已有一些研究[3-8]，羅玉[9]曾報道三島柴胡下胚軸離體培養(yǎng)的全息現(xiàn)象，張和禹等[10-11]對桑下胚軸、李永輝等[12]對黃瓜子葉和下胚軸、郟艷紅等[13]對番茄的子葉和下胚軸進(jìn)行了組織培養(yǎng)。但關(guān)于北柴胡幼根、子葉和下胚軸系統(tǒng)的組織培養(yǎng)技術(shù)還未見報道。

本試驗在柴胡化學(xué)成分分析的基礎(chǔ)上選擇有效成分含量高的北柴胡種子，通過種子萌發(fā)得到幼苗，再利用幼根、子葉和下胚軸組織培養(yǎng)，旨在為柴胡優(yōu)良品種的大規(guī)模繁殖提供技術(shù)數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

試驗用北柴胡種子取自陵川縣農(nóng)業(yè)開發(fā)區(qū)。

1.2 方法

1.2.1 北柴胡種子的萌發(fā) 選擇籽粒飽滿的北柴胡種子500粒，分成5份，每份100粒。采用1.0%高錳酸鉀浸種1 d，取出用清水洗凈，均勻播種于溫室育苗盆中，于20℃進(jìn)行恒溫暗培養(yǎng)，30 d后得到柴胡幼苗。

1.2.2 北柴胡愈傷組織的誘導(dǎo) 取北柴胡幼苗用75%的酒精浸泡30 s，然后用0.1%HgCl2水溶液處理8～10 min，無菌水沖洗3～5次。將消毒后的苗分成幼根、下胚軸和子葉3段，分別切成1 cm小段接種于不同激素配比的MS或B5基本培養(yǎng)上，培養(yǎng)基pH值為6.0～6.5（表1）。在26～28℃條件下暗培養(yǎng)，每30 d繼代一次，統(tǒng)計愈傷組織誘導(dǎo)率，記錄愈傷組織的顏色、質(zhì)地及生長狀況。最后，篩選出適宜的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基。

1.2.3 北柴胡不定芽的分化 分別將幼根、下胚軸和子葉的愈傷組織由三角瓶中取出，用解剖刀切成小塊，用無菌水洗凈瓊脂并接入附加不同濃度6-BA，NAA，和CH（水解酪蛋白）的MS或B5基本培養(yǎng)基上（表2）。每天光照12 h，光強度為2 000 lx，培養(yǎng)溫度26～28℃，40 d后進(jìn)行統(tǒng)計。

1.2.4 北柴胡生根培養(yǎng) 將5 cm左右的叢生苗切成單苗轉(zhuǎn)至生根培養(yǎng)基1/2 MS＋NAA 0.5 mg/L上，進(jìn)行生根培養(yǎng)。每日光照12 h，光照強度為2 000 lx，培養(yǎng)溫度26～28℃。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同培養(yǎng)基、外源激素配比對北柴胡幼根、下胚軸和子葉愈傷組織誘導(dǎo)的影響

培養(yǎng)8 d，下胚軸較幼根和子葉先開始形成愈傷組織。培養(yǎng)12d，幼根和子葉的切口處開始膨大。培養(yǎng)30 d，幼根、下胚軸和子葉形成愈傷組織。

從整體上看，MS培養(yǎng)基誘導(dǎo)愈傷組織的效果優(yōu)于B5培養(yǎng)基，0.1 mg/L KT的誘導(dǎo)愈傷組織效果優(yōu)于0.5 mg/LKT。2，4-D是柴胡愈傷組織誘導(dǎo)的主要激素，幼根和下胚軸是愈傷組織誘導(dǎo)的最佳材料。在MS＋2，4-D 1.0 mg/L＋KT 0.1 mg/L的培養(yǎng)基上，幼根和下胚軸愈傷組織誘導(dǎo)率均達(dá)100%，愈傷組織顏色為淡黃綠色，質(zhì)地較硬，生長狀態(tài)良好；子葉愈傷組織誘導(dǎo)率最高（92%），愈傷組織顏色較黃，質(zhì)地疏松，生長狀態(tài)良好（表1）。

表1 不同培養(yǎng)基、外源激素對北柴胡幼根、下胚軸和子葉愈傷組織誘導(dǎo)率的影響 %

2.2 不同培養(yǎng)基、外源激素配比對北柴胡愈傷組織誘導(dǎo)不定芽的影響

與幼根和子葉愈傷組織相比，下胚軸愈傷組織的分化能力最強，在分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)30 d左右，愈傷組織塊上開始分化芽，且分化芽的數(shù)量逐漸增多；培養(yǎng)到40 d時，分化出芽的愈傷組織開始有少量根的分化，分化率最高可達(dá)98%。葉片愈傷組織在培養(yǎng)過程中有少部分褐化死亡，大部分繼續(xù)分裂增殖，但分化能力較下胚軸愈傷組織弱，分化率最高為66%；幼根愈傷組織分化能力最差，分化率最高僅為20%。

從表2可以看出，在B5培養(yǎng)基中加入一定量的6-BA，NAA和CH有利于柴胡幼根、下胚軸和子葉愈傷組織分化芽，6-BA 1.5 mg/L＋NAA 0.03 mg/L＋CH 250 mg/L的培養(yǎng)基，幼根、下胚軸和子葉形成的愈傷組織分化率最高。

表2 不同培養(yǎng)基、外源激素配比對北柴胡愈傷組織不定芽誘導(dǎo)率的影響 %

2.3 生根、煉苗與移栽

將5 cm左右的柴胡無根苗移入生根培養(yǎng)基1/2 MS＋NAA 0.5 mg/L上，7 d后即形成不定根，不定根的誘導(dǎo)率為100%。當(dāng)試管苗長至10 cm、有5～6條粗根時，擰開瓶蓋，用封口膜封上，在封口膜上扎少許小孔，7 d后，撤去封口膜，再培養(yǎng)3 d，轉(zhuǎn)入蛭石中煉苗7 d。以上過程均在培養(yǎng)室內(nèi)進(jìn)行，之后即可移栽入大田。

3 討論

由北柴胡外植體誘導(dǎo)形成愈傷組織及愈傷組織分化誘導(dǎo)不定芽的研究已有報道[7]。但大田采集外植體受到采集時間和種植地的限制：過了適宜采集期，外植體培養(yǎng)的愈傷組織質(zhì)量不佳，分化能力差；種植地遠(yuǎn)，采集材料消耗時間長，途中保存不當(dāng)會造成材料萎蔫，分化能力下降。筆者在實驗室探索北柴胡種子發(fā)芽的適宜條件，提高了北柴胡種子發(fā)芽率，不受季節(jié)和柴胡種植地的影響，在溫室中得到柴胡幼苗，進(jìn)行組織培養(yǎng)研究。同時，下胚軸和子葉的愈傷組織分化能力也非常強，大大提高了北柴胡組織培養(yǎng)的效率。

本試驗中由下胚軸形成的愈傷組織質(zhì)地軟硬適中，分化率最高；而由幼根形成的愈傷組織分化率最差；由子葉形成的愈傷組織分化率居中。說明下胚軸是北柴胡由愈傷組織分化形成試管苗的最好材料。

試驗結(jié)果表明，愈傷組織誘導(dǎo)的最適基本培養(yǎng)基是MS培養(yǎng)基，而芽分化的最適基本培養(yǎng)基是B5培養(yǎng)基。

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