Akt/GSK－3β介導高糖上調(diào)腎小管上皮細胞Snail1的表達*

余 紅， 石明雋， 肖 瑛， 劉瑞霞， 王圓圓， 郭 兵， 張國忠

(貴陽醫(yī)學院病理生理學教研室，貴州貴陽550004)

我們前期的研究發(fā)現(xiàn)，在高糖培養(yǎng)和糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)大鼠腎小管上皮細胞中Snail1表達上調(diào)［1］，以siRNA抑制Snail1表達后，腎小管上皮細胞上皮－間充質轉化(epithelial－mesenchymal transition，EMT)標志蛋白表達出現(xiàn)逆轉［2］。并且有研究表明Snail1在人IgA腎病和糖尿病腎病患者腎小管上皮細胞表達增多［3］，提示Snail1促進腎小管上皮細胞EMT，參與了糖尿病腎損傷的病理過程。但對DN時Snail1表達上調(diào)的機制認識還十分有限。最近研究報道，DN腎小管上皮細胞EMT過程常常伴有蛋白激酶B(Akt)和糖原合成激酶3β(glycogen synthase kinase 3β，GSK－3β)的激活或異常表達［4，5］，提示它們參與了 DN 的發(fā)病機制。本研究旨在觀察Snail1、Akt和GSK－3β在高糖培養(yǎng)腎小管上皮細胞的表達變化，分析Akt/GSK－3β途徑與Snail1表達的關系。

材料和方法

1 材料

1.1 主要抗體和試劑 兔抗大鼠Akt1單克隆抗體、小鼠抗大鼠β－actin單克隆抗體、鏈親和素－生物素－過氧化物酶(SABC)試劑盒、生物素標記羊抗兔或羊抗小鼠IgG－HRP和兔抗羊IgG－HRP(武漢Boster);兔抗大鼠p－Akt(Ser473)多克隆抗體和ECL化學發(fā)光試劑盒(江蘇碧云天生物技術研究所);兔抗大鼠p－GSK－3β(Ser9)多克隆抗體(Cell Signal);羊抗大鼠GSK－3β多克隆抗體和羊抗大鼠Snail1多克隆抗體(Santa Cruz);低糖DMEM培養(yǎng)基和胰蛋白酶(HyClone);胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS;Gibco);轉鐵蛋白(Sigma);LY294002(Calbiochem);總RNA提取試劑盒、蛋白質 marker、2×Taq PCR MasterMix和600 bp DNA marker(天根);RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit(Fermentas)。PVDF膜、3 mm Whatman濾紙(Millipore)。

1.2 動物 雄性SD大鼠，清潔級，鼠齡20 d，體重(40±10)g，由貴陽醫(yī)學院實驗動物中心提供。

2 方法

2.1 大鼠原代腎小管上皮細胞(renal tubular epithelial cells，RTECs)的培養(yǎng)和鑒定 大鼠乙醚麻醉后股動脈放血處死。無菌取腎后，除去腎髓質部分，分離、剪碎腎皮質并置于80目、100目不銹鋼網(wǎng)篩過濾，分離腎小管節(jié)段。加入0.25%胰蛋白酶37℃水浴消化30 min，1 000 r/min離心，棄上清。加入含有10%FCS的DMEM培養(yǎng)液，接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中。置孵育箱(37℃、5%CO2)培養(yǎng)。72 h后全量更換培養(yǎng)液，以后每2～3 d換1次培養(yǎng)液。第5～6 d細胞貼壁生長達瓶底面積的80% ～90%時以0.5 mL 0.25% 胰蛋白酶消化液消化、傳代。倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)和生長特性，免疫細胞化學檢測CK－18和α－SMA表達，鑒定所培養(yǎng)的細胞［2］。取第3代細胞實驗。

2.2 實驗分組 細胞生長融合至約90%時，換無血清DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，使細胞生長同步將細胞分為:(1)對照組:DMEM(含糖5.5 mmol/L)+2%FBS培養(yǎng);(2)高滲組:20 mmol/L D－mannitol+DMEM+2%FBS培養(yǎng);(3)高糖組:20 mmol/L D－glucose+DMEM+2%FBS培養(yǎng)，分別在30 min、2 h、6 h、12 h、24 h、48 h 和 72 h 收集細胞提取蛋白和RNA;(4)LY294002抑制劑組:LY294002稀釋為 25 μmol/L，預處理細胞 50 min，再以 25 μmo/L LY294002+DMEM+2%FCS+20 mmo/L D－glucose 5 mL培養(yǎng)細胞24 h。24 h后收集細胞蛋白。每一實驗組均重復3次。

2.3 免疫細胞化學 細胞爬片經(jīng)4%多聚甲醛固定，0.5%Triton X－100打孔，3%H2O2去除內(nèi)源性過氧化物酶，血清封閉后，分別加入抗 CK－18(1∶100)和抗 α－SMA(1∶200)抗體，4 ℃孵育過夜，加入生物素化Ⅱ抗，室溫下孵育40 min。DAB顯色。PBS代替Ⅰ抗作陰性對照。

2.4 RT－PCR 按照試劑盒說明提取原代培養(yǎng)腎小管上皮細胞總RNA，并逆轉錄為cDNA。以cDNA為模板擴增 Snail1、Akt1、GSK－3β 和 β－actin，天根公司2×Taq MasterMix試劑盒行PCR擴增。引物由上海捷瑞生物工程技術服務有限公司合成，引物序列見表1。PCR擴增條件:95℃ 5 min預變性，94℃ 45 s變性，45 s退火，70℃ 45 s延伸，72℃ 10 min總延伸。1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測反應產(chǎn)物，凝膠成像系統(tǒng)掃描并分析擴增產(chǎn)物的積分吸光度值，以目標產(chǎn)物/β－actin積分吸光度比值表示靶基因的相對水平。

2.5 Western blotting 加 RIPA 裂解液 100 μL，12 000 r/min，4℃離心20 min，取上清。BCA法測蛋白濃度，加樣緩沖液變性蛋白，上樣，SDS－PAGE凝膠垂直電泳后，電轉移至PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，含0.05%Tween 20 的 TBS(TBS－T)沖洗后，分別以 anti－Snail1(1∶300)、anti－Akt1(1∶200)、anti－p－Akt(1∶300)、anti－GSK－3β(1∶300)、anti－p－GSK－3β(1∶300)和anti－β－actin抗體(1∶300)與PVDF膜4℃孵育過夜。加入用含1%脫脂牛奶的TBS－T稀釋辣根過氧化物酶連接的相應Ⅱ抗，室溫孵育2 h，ECL化學發(fā)光顯影。Bio－Rad凝膠成像系統(tǒng)進行圖像采集和分析，以β－actin蛋白條帶作內(nèi)參照，計算靶蛋白條帶與βactin蛋白條帶灰度的百分比值作為靶蛋白表達的相對水平。

表1 PCR引物序列及擴增條件Table 1.Sequences and conditions of the primers used in PCR

3 統(tǒng)計學處理

結 果

1 大鼠原代腎小管上皮細胞鑒定

倒置顯微鏡下可見，從培養(yǎng)24 h開始，卵圓形上皮樣細胞圍繞接種的腎小管節(jié)段呈島嶼狀長出，約第3～4 d形成集落，形態(tài)呈典型的多邊鵝卵石樣。經(jīng)胰酶消化傳代后，腎小管上皮細胞以單個細胞貼壁并呈對數(shù)生長，符合上皮細胞生長特性。免疫細胞化學結果顯示培養(yǎng)的細胞胞漿CK18蛋白表達陽性，α－SMA蛋白表達陰性，說明培養(yǎng)細胞為腎小管上皮細胞。

2 高糖培養(yǎng)不同時點原代腎小管上皮細胞Snail1、Akt1和GSK－3β mRNA的表達

在原代培養(yǎng)的RTECs，正常糖對照組Snail1和Akt1 mRNA少量表達，高糖刺激30 min即可檢測到Snail1和Akt1 mRNA表達較正常對照組明顯增多，差異顯著，并隨高糖刺激時間的延長逐漸增加。高滲組和正常糖組比較，Snail1、Akt1 mRNA表達無顯著差異。高糖刺激后GSK－3β mRNA的表達與正常糖和高滲組比較無顯著差異，見圖1。

Figure 1.Expression of Snail1，Akt1 and GSK－3β mRNA detected by RT－PCR in primary cultured renal tubular epithelial cells incubated in normal－glucose(control，C)，mannitol(M)and high－glucose(HG)media at different time points.±s.n=3.*P ＜ 0.01 vs C.圖1 Snail1、Akt1和GSK－3β mRNA在不同處理組原代培養(yǎng)腎小管上皮細胞的表達

3 高糖培養(yǎng)不同時點原代腎小管上皮細胞Snail1、Akt1、p－Akt、GSK－3β和 p－GSK－3β蛋白的表達

Snail1蛋白在正常糖對照組腎小管上皮細胞幾乎不表達，高糖培養(yǎng)后Snail1蛋白隨培養(yǎng)時間延長而呈遞增趨勢。從高糖培養(yǎng)30 min起Snail1蛋白表達即較正常糖對照組顯著增加，至72 h Snail1蛋白表達雖有減少，但仍高于正常糖組。正常糖組Akt1、p－Akt和p－GSK－3β蛋白有少量表達，高糖刺激30 min始腎小管上皮細胞三者表達均顯著增多，Akt1隨刺激時間延長逐漸增加，而p－Akt和 p－GSK－3β蛋白于24 h達高峰，此后略有下降。高糖刺激對總GSK－3β蛋白表達無顯著影響。各時點高滲組 Snail1、Akt1、p－Akt、GSK－3β 和 p－GSK－3β蛋白的表達與正常糖組比較無明顯差異，見圖2。

Figure 2.Expression of Snail1，Akt1，p－Akt，GSK－3β and p－GSK－3β proteins detedted by Western blotting in primary cultured renal tubular epithelial cells incubated in normal－glucose(M)，mannitol and high－glucose(HG)media at different time points.±s.n=3.#P＜0.05，*P＜0.01 vs C.圖2 Snail1、Akt1、p－Akt、GSK3β和p－GSK3β蛋白在不同處理組原代培養(yǎng)腎小管上皮細胞的表達

4 LY294002 處理對 Snail1、Akt1、p－Akt、GSK－3β和p－GSK－3β蛋白表達的影響

在培養(yǎng)的RTECs，高糖刺激后Snail1、p－Akt和p－GSK－3β蛋白表達明顯增加，LY294002處理組Snail1、p－Akt和p－GSK－3β表達較高糖組明顯減少。但LY294002對總Akt1和總GSK－3β蛋白的表達沒有顯著影響，見圖3。

Figure 3.Effects of LY294002，a PI3K inhibitor，on Snail1，Akt1，p－Akt，GSK－3β and p－GSK－3β protein expression in primary cultured renal tubular epithelial cells incubated with high glucose.The protein expression was examined by Western blotting assay.C:control;HG:high glucose;In:LY294002+high glucose.±s.n=3.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs C;##P ＜0.01 vs HG.圖3 LY294002對高糖培養(yǎng)腎小管上皮細胞Snail1、Akt1、p－Akt、GSK－3β和p－GSK－3β蛋白表達的影響

5 相關性分析

對體外培養(yǎng)各組腎小管上皮細胞中Snail1蛋白與p－Akt和p－GSK－3β蛋白的表達量進行相關性分析，結果發(fā)現(xiàn)，Snail1蛋白表達分別和p－Akt、p－GSK－3β 蛋白表達呈正相關(r=0.794，P ＜0.01;r=0.755，P ＜0.01)。

討 論

我們利用原代腎小管上皮細胞研究高血糖引起腎臟損傷的發(fā)病機制，相對于細胞株，原代腎小管上皮細胞直接來源于機體組織，更接近和反映體內(nèi)生長特性。培養(yǎng)的細胞經(jīng)形態(tài)學和免疫細胞化學鑒定，其形態(tài)符合小管上皮細胞的特點，上皮細胞標志物CK－18蛋白表達陽性，且未見間質細胞標志蛋白α－SMA表達，證實我們分離培養(yǎng)的細胞為腎小管上皮細胞。研究以相同滲透壓的甘露醇為對照，排除滲透壓變化的影響，動態(tài)觀察不同培養(yǎng)條件和不同時點相關指標的變化與高血糖狀態(tài)的關系。

本研究發(fā)現(xiàn)，高糖培養(yǎng)30 min腎小管上皮細胞Snail1蛋白表達開始增加，至24 h時都維持于較高水平，48 h和72 h后表達有所下降，但表達量仍然明顯高于對照組。Snail1 mRNA也表現(xiàn)出相似的趨勢。這提示Snail1基因在正常腎組織中保持沉默，而在糖尿病時異常激活，通過蛋白表達而發(fā)揮作用。與本課題組前期的發(fā)現(xiàn)及其他學者的報道一致［1，3］。另外，我們還發(fā)現(xiàn)，高糖培養(yǎng)各時點腎小管上皮細胞Snail1蛋白表達上調(diào)同時伴有Akt1、p－Akt和p－GSK－3β蛋白表達的增加以及Akt1 mRNA的表達增加，而高滲透壓對這些指標沒有影響。這說明，糖尿病時，引起 Snail1、Akt1、p－Akt和p－GSK－3β 蛋白或mRNA表達改變的主要原因并非高滲透壓，而是高血糖本身;高糖不僅能上調(diào)Akt1總蛋白的表達，同時還激活Akt信號分子，但高糖并不影響總GSK－3β蛋白的表達水平，只是使其功能狀態(tài)發(fā)生改變。這種改變可能是高糖激活 Akt后，進而使GSK－3β磷酸化失活的結果。

Snail1 mRNA于高糖刺激2 h開始有意義增高，晚于蛋白的增高，提示高糖引起Snail1蛋白表達上調(diào)不僅是通過轉錄水平調(diào)節(jié)，還存在其它調(diào)節(jié)機制。最近對肝細胞癌、皮膚癌等腫瘤的研究表明，Snail1的表達可能受到Akt/GSK－3β介導的翻譯后機制調(diào)節(jié)?；罨腁kt能與 GSK－3β結合，誘導 GSK－3β向細胞膜轉位，磷酸化其N端的Ser9活性位點使之失活。無活性的p－GSK－3β使Snail1泛素化降解減少，核移位增加，促進EMT標志蛋白的轉錄調(diào)節(jié)［6－9］。我們觀察到，高糖誘導的腎小管上皮細胞Snail1蛋白過表達同時伴有p－Akt和p－GSK－3β蛋白表達的增加。而最近研究也報道，Akt信號分子及其下游GSK－3β磷酸化后活性改變，與TGF－β1等因素誘導的腎纖維化中腎小管EMT過程有關［10－11］。那么，在糖尿病腎間質纖維化損害中，是否Akt/GSK－3β信號通路也參與了Snail1表達的調(diào)節(jié)，進而調(diào)節(jié)EMT?我們以LY294002處理高糖培養(yǎng)的RTECs。LY294002為Akt上游信號分子磷脂酰肌醇3－激酶(phosphatidylinositol 3－kinase，PI3K)的特異性抑制劑，以往研究表明，LY294002可通過特異的競爭性抑制PI3K p110亞基的ATP結合位點而抑制PI3K的催化活性，進而抑制Akt的激活。以LY294002處理后，高糖培養(yǎng)的RETCs p－Akt蛋白、p－GSK－3β及Snail1蛋白表達均減少，但總Akt1和GSK－3β蛋白的表達不受影響。而且，相關性分析顯示，Snail1蛋白的表達不僅與p－Akt蛋白表達高度正相關，也與p－GSK－3β蛋白表達正相關。這一結果提示，高糖條件下，Akt可能通過PI3K依賴的方式被激活，進而使 GSK－3β磷酸化失功能，Snail1降解減少，促進了Snail1表達上調(diào)。最近Lee等［5］分別以Akt抑制劑和GSK－3β抑制劑處理高糖培養(yǎng)的腎小管上皮細胞，Akt抑制劑逆轉高糖引起的GSK－3β磷酸化失活，GSK－3β活性受到抑制劑抑制后，則出現(xiàn)Snail1蛋白的蓄積和EMT，與我們的結果相似。

綜上所述，我們推測高糖可能經(jīng)Akt/GSK－3β途徑使腎小管上皮細胞Snail1蛋白水平上調(diào)。因此，DN時可能存在Akt/GSK－3β/Snail1的功能軸，通過促進腎小管上皮細胞的轉化而導致腎纖維化。

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