陳皮飲片高效液相指紋圖譜研究＊

封宇飛，張宏武，鄒忠梅，孫春華

(1.衛(wèi)生部北京醫(yī)院藥學部，北京 100730;2.中國醫(yī)學科學院·中國協(xié)和醫(yī)科大學藥用植物研究所，北京100094)

陳皮(Pericarpium Citri Reticulatae)為蕓香科植物橘(Citrus reticulate Blanco)及其栽培變種的干燥的成熟果實，原名“橘皮”，性溫，味苦、辛，有理氣健脾、燥濕化痰等功效，臨床上用于胸脘脹滿、食少吐瀉、咳嗽痰多等癥?，F(xiàn)代藥理學研究表明，陳皮具有升壓、抗腫瘤、抗炎、抗菌、降血脂、抗過敏和抗哮喘等作用[1－3]。2005年版《中國藥典(一部)》中，采用性狀鑒別的定性手段和單一指標成分橙皮苷的定量測定來控制陳皮的質(zhì)量。另外，有文獻報道對陳皮中的揮發(fā)油、生物堿(如辛弗林)及黃酮類化合物如橙皮苷和川陳皮素等進行含量測定[4－8]。雖然這些方法能夠在一定程度上控制陳皮飲片的質(zhì)量，但難于客觀、有效的評價或控制藥材的質(zhì)量。而中藥指紋圖譜研究作為現(xiàn)代中藥質(zhì)量控制和鑒別的新興技術，為質(zhì)量評價問題的解決提供了新的思路和方法。目前，指紋圖譜已成為國際上公認的控制中藥或天然藥物質(zhì)量的最有效的手段。美國食品與藥物管理局、英國草藥典、印度草藥、德國藥用植物學會、加拿大藥用植物學會均接受色譜指紋圖譜的質(zhì)控方法。其優(yōu)點在于可全面反映中藥復雜的化學成分及其相對比例，在大多數(shù)中藥有效成分尚未闡明的現(xiàn)狀下，仍可有效地表征中藥質(zhì)量[9－10]。筆者采用反相高效液相色譜法，建立可反映陳皮飲片全貌的指紋圖譜，為陳皮的綜合質(zhì)量評價提供參考。

1 儀器與試藥

Waters 2690型高效液相色譜儀(996PDA二極管陣列檢測器，515泵，Empower pro工作站);梅特勒AT201型十萬分之一電子天平;RT－02A小型高速粉碎機;Millipore超純水機，Heidolph LABOROTA 4000旋轉蒸發(fā)儀;中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)軟件(2004A，國家藥典委員會)。橙皮苷對照品(中國藥品生物制品檢定所，含量98.3%);43批陳皮飲片采購于全國22個省市，中國醫(yī)科院藥用植物研究所林余霖副研究員鑒定確認，均為干燥生品(表1);乙腈為色譜純(Fisher，美國)，甲酸為分析純，水為Milli－Q純化系統(tǒng)制備的超純水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱:Waters Symmetry C18柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm);流動相:0.1%甲酸水溶液(A)－乙腈(B)，梯度洗脫(0～20 min，A為 90%;20～35 min，A 為 75% ～90%;35～50 min，A 為 30% ～75%;50～60 min，A為 30% ～90%);檢測波長:300 nm;流速:1.0 mL/min;柱溫:25 ℃;自動進樣器溫度:4 ℃，進樣量:10 μL。

2.2 溶液制備

精密量取橙皮苷對照品10.0 mg，置100 mL容量瓶中，加甲醇溶解，稀釋并定容，作為橙皮苷對照品貯備液。精密量取對照品貯備液1 mL，置10 mL容量瓶中，加水定容至刻度，搖勻，0.22 μm微孔濾膜過濾后，作為對照品溶液。稱取陳皮飲片約50.0 g，用粉碎機粉碎，過篩，精密稱取10.0 g(24～65目)，置250 mL平底燒瓶中，加100 mL水，水浴加熱(60℃)回流提取1 h，放冷，真空過濾，藥渣加入100 mL水同樣操作提取2次，每次1 h，過濾，合并過濾液，減壓濃縮，移至100 mL容量瓶，加水定容，為樣品原液。精密量取原液1 mL，置100 mL量瓶中，加水定容至刻度，搖勻，0.22 μm微孔濾膜過濾后，作為供試品溶液。

2.3 檢測方法

分別精密吸取對照品溶液和供試品溶液各10 mL，注入液相色譜儀，記錄100 min內(nèi)色譜圖。結果表明，65 min后無有意義峰出現(xiàn)，故確定圖譜記錄時間為65 min。對照品和樣品色譜圖分別見圖1。根據(jù)參照峰的保留時間和峰面積計算其他共有峰的相對保留時間和相對峰面積值。

表1 陳皮樣品來源及相似度計算結果

圖1 高效液相色譜圖

2.4 方法學考察

精密度試驗:取同一供試品溶液，連續(xù)進樣5次，檢測指紋圖譜。計算各共有色譜峰的相對保留時間和相對峰面積的 RSD值，各色譜峰的相對保留時間 RSD為0.02% ～0.41%，色譜峰的相對峰面積的 RSD為0.75% ～1.36%。精密度試驗符合指紋圖譜研究技術的要求。

穩(wěn)定性試驗:取同一批供試品溶液，按照上述色譜條件，分別于0，6，12，18，24 h檢測指紋圖譜。結果其共有峰峰面積 RSD均小于2.0%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

重復性試驗:取同一批陳皮飲片5份，依法制備供試品溶液，并按照上述色譜條件分別檢測指紋圖譜，考察各共有峰相對峰面積，各供試品溶液的主要共有峰的相對峰面積 RSD均小于5%。結果表明，該方法的重現(xiàn)性良好。

2.5 樣品測定結果

陳皮飲片指紋圖譜測定:對中藥陳皮飲片進行高效液相色譜指紋圖譜測定分析。結合各地不同飲片的色譜峰狀況，選擇高效液相色譜圖中可以用于反映飲片內(nèi)在質(zhì)量的共有峰，以參照物峰(S)的保留時間和峰面積為1，計算其余各峰的相對保留時間和相對峰面積，并計算不同飲片各個產(chǎn)地的高效液相色譜指紋圖譜的相似性。將各地的陳皮飲片按樣品制備方法制備樣品，并在2.1項色譜條件下檢測HPLC指紋圖譜，根據(jù)不同產(chǎn)地樣品分析的結果，標定共有峰，見圖2。共有峰的峰面積占總峰面積的95%以上，非共有峰的峰面積在總峰面積中所占比例小于5%，所選擇的共有峰可以較全面地反映樣品中化學成分的信息。

圖2 43批陳皮飲片匹配后指紋圖譜

陳皮飲片的指紋分析圖:應用指紋圖譜相似度評價軟件對各地的陳皮飲片指紋圖譜進行譜圖比較，并對譜圖校正匹配。見圖2。

陳皮飲片的指紋圖譜相似度計算:應用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)研究版(2004A)”(國家藥典委員會)，對各地的陳皮飲片指紋圖譜進行相似度計算，以相關系數(shù)表示相似度。結果38批陳皮飲片指紋圖譜的相似度在0.85以上，結果見表1及圖3。陳皮飲片的指紋圖譜相對峰面積值計算見表2。

3 討論

3.1 流動相選擇

陳皮飲片所含成分復雜，且各種類型的化合物極性差別較大，在等度洗脫時，改變流動相的組成或比例只能得到較少的色譜峰，并且洗脫時間長，色譜峰分離度差。改梯度洗脫，樣品中不同極性組分均獲得了合適保留，在65 min內(nèi)各組分全部出峰。試驗過程中選用了多種流動相，如甲醇 －0.1%甲酸、甲醇－乙腈 －0.1%甲酸、乙腈－0.1%甲酸的不同梯度洗脫。由于醇－水系統(tǒng)的熱力學和可壓縮性因素，在梯度洗脫時易導致基線漂移;且醇－甲酸系統(tǒng)柱壓相對較高，而乙腈相對較好，且所得指紋圖譜峰數(shù)較多，故試驗選取3號系統(tǒng)為流動相。比較了4個不同柱溫，發(fā)現(xiàn)隨柱溫上升各色譜峰保留時間略有提前，但分離度以25℃為佳。故選擇25℃為指紋圖譜檢測柱溫。

圖3 全國不同省市的43批市售樣品的相似度分布

表2 43批樣品飲片指紋圖譜共有峰的相對峰面積值

3.2 波長選擇

結果表明，波長300 nm檢測時，其高效液相圖譜中可觀察到較多的色譜峰，同時各色譜峰分離較好，并且在此波長處各色譜峰的吸收均較強，故確定300 nm為檢測波長。

3.3 提取方式選擇

4種提取方法的提取效果可從高效液相色譜圖中看出，以甲醇作為溶劑所得到的提取液，其橙皮苷的含量很高，即橙皮苷提取率很高，而從峰個數(shù)上看，其峰數(shù)很少;水回流提取液的效果卻恰恰相反。加熱回流較超聲提取率要高。并且，傳統(tǒng)陳皮飲片采用水煎(水提)，因此，筆者采用水加熱回流提取作為最佳提取方法。研究中還發(fā)現(xiàn)，橙皮苷、柚皮蕓香苷、川陳皮素、3，5，6，7，8，3'，4'－七甲氧基黃酮及紅橘素不易溶于冷水，較溶于熱水中。為了減少這現(xiàn)象給試驗帶來的影響，水提物應趁熱濾過。

3.4 對照品選擇

陳皮中含有黃酮類化合物、揮發(fā)油及生物堿等，各類成分均能在一定程度上代表陳皮的某些藥理活性，其中，橙皮苷為其主要活性成分之一，同時，筆者研究發(fā)現(xiàn)該成分在陳皮飲片中含量最高。因此，選擇橙皮苷作為對照品。

3.5 指紋圖譜相似度評價

采用高效液相色譜法對陳皮飲片的指紋圖譜進行了研究，各樣品圖譜雖存在一定差異，但均具有相同的色譜特征峰。該方法一次進樣即能得到眾多的色譜峰，分離分析效率高，且各色譜峰保留時間相當穩(wěn)定，所建立的指紋圖譜具有穩(wěn)定性和可控性。

分析了全國不同省市市售43批陳皮飲片指紋圖譜，共有11個特征峰，各色譜峰的保留時間匹配總體較好，保留時間 RSD均小于5%。但因樣品的個體差異，特征峰的相對含量分布差異較大。樣品編號為 8，16，19，21，23 的相似度在 0.576 ～0.787 之間，質(zhì)量與其他大多數(shù)樣品存在較大差異，建議將相似度0.85作為判定陳皮飲片合格與否的限度。結果表明，全國各地的市售陳皮飲片質(zhì)量不統(tǒng)一，這更迫切的要求我們建立可靠的質(zhì)量標準來控制藥材的質(zhì)量，同時也說明相似度與藥材銷售地相關。

[1]嚴寒靜，房志堅，黃 寧.中藥陳皮揮發(fā)油的成分分析[J].廣東藥學，2001，11(1):17 －18.

[2]沈明勤，葉齊下，常復蓉.陳皮水溶性生物堿的升壓作用量－效關系及藥動學研究[J].中國藥學雜志，1997，32(2):97－100.

[3]王妹梅，何春美.陳皮提取物清除自由基和抗脂質(zhì)過氧化作用[J].中國藥科大學學報，1998，29(6):462 －465.

[4]俞建平，張紅玉，邱靜帆.HPLC法測定咳喘平中橙皮苷的含量[J].中國現(xiàn)代應用藥學，2001，18(5):388 －389.

[5]蔡 萍，張水寒，肖 娟，等.HPLC測定湖南道地藥材陳皮中橙皮苷的研究[J]，中醫(yī)藥導報，2006，12(4):65 －67.

[6]賈曉斌，施亞芳，黃一平，等.HPLC測定蘇州地區(qū)陳皮中辛弗林含量[J].南京中醫(yī)藥大學學報:自然科學版，1999，15(1):27－28.

[7]胡艷飛，王長海.微波法提取陳皮中 3，5，6，7，8，3'，4'－ 七甲氧基黃酮及其含量測定[J].煙臺大學學報:自然科學與工程版，2005，18(1):45－49.

[8]廖 斌，陳鐘華.離子對色譜法測定昔奈福林含量)[J].中國藥科大學學報，1997，28(2):94－96.

[9]李曉蒙，何新榮.秦艽藥材HPLC指紋圖譜研究[J].中成藥，2004，26(1):4－7.

[10]王振月，孫 暉，崔紅花，等.毛脈酸模不同生長發(fā)育期HPLC色譜指紋圖譜研究[J].植物研究，2005，25(1):53－58.