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    重組人生長激素對(duì)癲癇持續(xù)狀態(tài)大鼠神經(jīng)元凋亡及XIAP、Caspase-3表達(dá)的影響

    2012-09-13 09:06:26郝慶偉鄭輯英李光來薛國芳
    關(guān)鍵詞:棕黃色胞漿陽性細(xì)胞

    郝慶偉,鄭輯英,李光來,薛國芳,耿 瑜

    癲癇持續(xù)狀態(tài)(SE)是常見的臨床急癥,是細(xì)胞層面的自身失控性發(fā)作。國際癲癇組織定義為癲癇連續(xù)發(fā)作之間意識(shí)未完全恢復(fù)又頻繁再發(fā),或發(fā)作持續(xù)30min以上不自行停止。癲癇連續(xù)發(fā)作30min后,海馬神經(jīng)元開始死亡[1]。細(xì)胞凋亡是SE后腦神經(jīng)元死亡的形式之一,在SE后腦神經(jīng)元死亡過程中扮演重要角色。近年來,一些研究表明,生長激素(GH)能改善大腦缺血缺氧引起的損傷,抑制細(xì)胞凋亡,促進(jìn)細(xì)胞存活等作用[2,3]。本實(shí)驗(yàn)通過應(yīng)用重組人生長激素(rhGH)觀察大鼠SE后大鼠腦組織凋亡相關(guān)基因XIAP、Caspase-3的表達(dá)情況,探討rhGH干預(yù)對(duì)SE導(dǎo)致的神經(jīng)元損傷的影響及其可能機(jī)制,以期為rhGH應(yīng)用于臨床SE的治療提供動(dòng)物實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料 健康成年雄性 Wistar大鼠54只,鼠齡3個(gè)月~4個(gè)月,體重180g~240g,山西醫(yī)科大實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。重組人生長激素注射液由長春金賽藥業(yè)有限責(zé)任公司生產(chǎn);匹羅卡品購自美國Sigma公司;兔抗鼠XIAP多克隆抗體、兔抗鼠Caspase-3多克隆抗體、TUNEL試劑盒、即用型SABC試劑盒均系武漢博士德公司提供;氯化鋰購自中國醫(yī)藥集團(tuán)上海試劑公司;DAB試劑由北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司出品;余均為市售分析純品。

    1.2 動(dòng)物分組及模型的建立 選用健康成年雄性Wistar大鼠54只,隨機(jī)分為對(duì)照組6只,模型組、rhGH組各24只。模型組、rhGH組再分為4個(gè)亞組,每個(gè)亞組6只,分別對(duì)應(yīng)癲癇持續(xù)狀態(tài)后6h、12h、24h和48h四個(gè)時(shí)間點(diǎn)。rhGH組頸部皮下注射重組人生長激素0.1U/(kg·d),對(duì)照組、模型組頸部皮下注射等容積生理鹽水。持續(xù)一周,1次/24h。注射5d后,除對(duì)照組外,其余各組均腹腔注射氯化鋰127mg/kg,18h后再腹腔注射新鮮配制的毛果蕓香堿(匹羅卡品)30mg/kg,對(duì)照組給予等容積生理鹽水腹腔注射。觀察大鼠出現(xiàn)癲癇發(fā)作的時(shí)間和行為表現(xiàn),癇性發(fā)作持續(xù)超過30min為SE。在SE達(dá)1h時(shí),腹腔注射地西泮10mg/kg,終止癇性發(fā)作。在癲癇持續(xù)狀態(tài)后6h、12h、24h和48h分別斷頭取腦,對(duì)大鼠海馬組織進(jìn)行研究,進(jìn)行各指標(biāo)的檢測(cè)。驚厥評(píng)分采用Racine評(píng)分法,出現(xiàn)3級(jí)以上發(fā)作提示造模成功,造模過程中大鼠出現(xiàn)死亡或不符合模型要求者,予以剔除并隨機(jī)補(bǔ)充,以保證每組動(dòng)物6只。

    1.3 標(biāo)本處理 各相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)大鼠用25%烏拉坦4mL/kg深麻醉后,斷頭取腦,大鼠腦組織置入4%多聚甲醛中固定,常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋后,在視交叉后海馬區(qū)連續(xù)冠狀切片,片厚5μm,每隔15張連續(xù)取4張,相鄰切片分為四套,分別進(jìn)行各指標(biāo)的檢測(cè)。HE染色,光鏡下觀察形態(tài)學(xué)變化。

    1.4 細(xì)胞凋亡檢測(cè) 采用TUNEL法檢測(cè),按試劑盒提供的方法進(jìn)行操作,細(xì)胞核中有棕黃色顆粒者即為陽性細(xì)胞,即凋亡細(xì)胞。

    1.5 XIAP、Caspase-3檢測(cè) 采用SABC法(鏈霉親和素-生物素過氧化酶連接法)免疫組化步驟按照試劑盒推薦方法進(jìn)行(常規(guī)SABC法,DAB染色)。胞漿或核膜染色呈棕黃色為蛋白陽性表達(dá)。

    1.6 結(jié)果處理 每張切片取5個(gè)視野,在BI-2000圖像分析系統(tǒng)下用400倍顯微鏡下分別測(cè)定每個(gè)視野XIAP、Caspase-3、TUNEL陽性細(xì)胞個(gè)數(shù),然后計(jì)算平均陽性細(xì)胞數(shù)。胞漿或核膜內(nèi)染色呈棕黃色為XIAP蛋白陽性表達(dá);胞漿或胞核內(nèi)有棕黃色沉淀物為Caspase-3蛋白陽性表達(dá);細(xì)胞核中有棕黃色顆粒者即為TUNEL陽性細(xì)胞。

    2 結(jié) 果

    2.1 發(fā)作行為觀察 正常對(duì)照組均未出現(xiàn)癲癇發(fā)作。模型組和rhGH組大鼠在給予匹羅卡品后10min~30min均出現(xiàn)豎毛,流涎,節(jié)律性點(diǎn)頭,洗臉樣動(dòng)作等面部痙攣樣動(dòng)作,接著出現(xiàn)單側(cè)或雙側(cè)前肢陣攣、站立,進(jìn)一步發(fā)展為全身強(qiáng)直-陣攣發(fā)作,雙側(cè)后肢強(qiáng)直,身體背屈,跌倒,反復(fù)發(fā)作,達(dá)到癲癇持續(xù)狀態(tài)。

    2.2 XIAP蛋白的表達(dá) XIAP陽性細(xì)胞主要分布在海馬CA1區(qū)和CA3區(qū),其陽性細(xì)胞染色主要為胞漿、突起及核膜中呈棕黃色。對(duì)照組XIAP陽性細(xì)胞僅有微量的基礎(chǔ)表達(dá)。與對(duì)照組相比,模型組6h時(shí)XIAP表達(dá)開始增強(qiáng)(P<0.05),12h時(shí)XIAP的表達(dá)達(dá)到高峰(P<0.05),24h時(shí)XIAP的表達(dá)開始減弱(P<0.05),48h時(shí)XIAP的表達(dá)明顯減弱(P<0.05)。rhGH組與模型組相比,SE后各個(gè)時(shí)間點(diǎn)(除6h外)XIAP蛋白的表達(dá)均顯著高于模型組(P<0.05),表現(xiàn)為胞漿及核膜染色,呈棕黃色,胞漿內(nèi)有棕黃色顆粒聚集。詳見表1。

    表1 各組大鼠海馬XIAP陽性細(xì)胞數(shù)比較(±s)

    表1 各組大鼠海馬XIAP陽性細(xì)胞數(shù)比較(±s)

    組別6h 12h 24h 48h對(duì)照組12.71±1.66模型組 27.35±1.991) 42.05±2.191) 36.17±2.111) 25.43±1.381)rhGH組 32.24±1.251) 55.90±2.371)2) 44.32±1.221)2) 36.92±2.011)2)與對(duì)照組比較,1)P<0.05;與模型組比較,2)P<0.05

    2.3 Caspase-3蛋白的表達(dá) Caspase-3陽性細(xì)胞主要分布在海馬CA1區(qū)和CA3區(qū),其陽性細(xì)胞染色主要表現(xiàn)為胞漿或胞核內(nèi)有棕黃色沉淀物。正常對(duì)照組可見大鼠海馬內(nèi)少量的弱染色的、散在的Caspase-3陽性細(xì)胞。與對(duì)照組相比,模型組6 h時(shí)可見海馬區(qū)內(nèi)陽性細(xì)胞數(shù)開始增多;12h時(shí)可見較多細(xì)胞的胞漿和核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色沉淀物;隨時(shí)間點(diǎn)延長而表達(dá)增加,24 h時(shí)陽性細(xì)胞及染色深度達(dá)高峰;48h時(shí)減少。rhGH組與模型組相比,6h時(shí)陽性細(xì)胞數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;12h時(shí)可見較多陽性細(xì)胞,染色較深;Caspase-3陽性細(xì)胞仍在24h達(dá)高峰,但相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)Caspase-3陽性細(xì)胞的表達(dá)較模型組輕微,各時(shí)間點(diǎn)Caspase-3表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見表2。

    表2 各組大鼠海馬Caspase-3陽性細(xì)胞數(shù)比較(±s)

    表2 各組大鼠海馬Caspase-3陽性細(xì)胞數(shù)比較(±s)

    組別6h 48h對(duì)照組2.34±1.13模型組 13.15±1.831) 26.44±1.091)rhGH組 11.36±2.181) 14.05±1.271)2) 23.05±2.541)2) 17.37±2.171)2)與對(duì)照組比較,1)P<0.05;與模型組比較,2)P<0.05

    2.4 細(xì)胞凋亡檢測(cè) TUNEL陽性細(xì)胞要分布在海馬CA1區(qū)和CA3區(qū),其陽性細(xì)胞核染色呈棕黃色。對(duì)照組僅有少量的、散在的TUNEL陽性細(xì)胞表達(dá),著色較淺。模型組6h時(shí)TUNEL陽性細(xì)胞表達(dá)開始增多,并隨時(shí)間點(diǎn)的延長陽性細(xì)胞表達(dá)增加,24h達(dá)高峰,48h減少。與模型組相比,rhGH組TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)仍在24h達(dá)高峰,但相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)TUNEL陽性細(xì)胞的表達(dá)均低于模型組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見表3。

    表3 各組大鼠海馬TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)比較(±s)

    表3 各組大鼠海馬TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)比較(±s)

    組別6h 12h 24h 48h對(duì)照組3.15±0.67模型組 16.43±1.321) 31.33±2.061) 42.96±1.221) 28.95±2.031)rhGH組 13.86±1.311) 19.15±1.221)2) 31.07±1.241)2) 19.86±1.131)2)與對(duì)照組比較,1)P<0.05;與模型組比較,2)P<0.05

    3 討 論

    在大腦癲癇持續(xù)狀態(tài)損傷過程中,有大量神經(jīng)元凋亡。細(xì)胞凋亡(apoptosis)又稱為程序性細(xì)胞死亡,是正常細(xì)胞在受到生理性和病理性刺激后,出現(xiàn)的一種自發(fā)性死亡過程。細(xì)胞凋亡現(xiàn)已成為國內(nèi)外研究的熱點(diǎn),在已取得許多非常有價(jià)值的成果中,Caspase的蛋白酶在細(xì)胞凋亡過程中起了重要的作用,通過特異性地裂解底物而發(fā)揮其執(zhí)行細(xì)胞凋亡的作用。目前,人體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的IAPs有8個(gè),其中XIAP是唯一可與凋亡啟動(dòng)因子Caspase-9及效應(yīng)因子Caspase-3、Caspase-7相結(jié)合的凋亡抑制蛋白。

    GH是由垂體前葉嗜酸細(xì)胞分泌的一種非糖基化蛋白。其主要功能包括促進(jìn)機(jī)體生長,減少蛋白質(zhì)消耗,同時(shí),GH與神經(jīng)內(nèi)分泌及免疫系統(tǒng)有著密切的聯(lián)系。GH可以通過抑制酪氨酸磷酸化與干擾素所啟動(dòng)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑而下調(diào)誘生型一氧化氮合酶的產(chǎn)生,進(jìn)而減少細(xì)胞毒作用,甚至還可以抑制脂多糖誘導(dǎo)單核細(xì)胞所產(chǎn)生的腫瘤壞死因子,從而減輕炎癥反應(yīng),而這對(duì)減輕大腦癲癇持續(xù)狀態(tài)損傷后減少神經(jīng)元的凋亡有一定的益處。但其具體機(jī)制尚不清楚,有待進(jìn)一步研究,但這有可能為臨床治療癲癇持續(xù)狀態(tài)提供一個(gè)新的思路和方法。

    [1]Edward MM.Status epilepticus:Current treatment strategies[J].The Neurohospitalist,2011(1):23-31.

    [2]Azcoitia I,Perez-Martin M,Salazar V,etal.Growth hormone prevents neuronal loss in the aged rat hippocampus[J].Neurobiol Aging,2005,26(5):697-703.

    [3]Shin DH,Lee E,Kim JW,etal.Protective effect of growth hormone on neuronal apoptosis after hypoxia-ischemia in the neonatal rat brain[J].Neuroscience Letters,2004,354(1):64-68.

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