乳清蛋白酶解物的抗氧化活性研究

許女，西艷雙，楊莉榕

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山西太谷030801）

乳清蛋白酶解物的抗氧化活性研究

許女，西艷雙，楊莉榕

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山西太谷030801）

研究在不同的酶種類、[E/S]、酶解時(shí)間下，乳清蛋白酶解物的抗氧化活性。結(jié)果表明，在胃蛋白酶37℃，[E/S]為0.15%，水解溫度水解時(shí)間2 h；胰蛋白酶[E/S]為0.4%，水解溫度50℃，水解時(shí)間2 h的條件下，乳清蛋白的酶解物有較強(qiáng)的抗氧化活性。

乳清蛋白；酶解物；抗氧化活性

Abstract:The effect of different types of enzymes,[E/S],hydrolysis time on antioxidant activity of whey protein hydrolysate were studied in this paper.The results showed that the optimum two enzyme hydrolysis conditions respectively was:pepsin[E/S]0.15%,37℃,hydrolysis time 2 h;trypsin[E/S]0.4%,50℃,hydrolysis time 2 h,while the whey protein hydrolysate has a good antioxidant activity.

Key words：whey protein;hydrolysate;antioxidant activity

乳清蛋白主要來(lái)源于干酪生產(chǎn)的副產(chǎn)物乳清，是乳沉淀酪蛋白后分離出來(lái)的蛋白質(zhì)，富含多種必需氨基酸，β-乳球蛋白（β－LG）、α-乳白蛋白（α－LA）、牛血清蛋白（BSA）、免疫球蛋白、乳鐵蛋白（LF）、糖巨肽（CGMP）、乳過(guò)氧化物酶等多種活性成分，是國(guó)際上公認(rèn)的人體最優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)補(bǔ)充劑之一[1-2]。國(guó)外對(duì)乳清蛋白酶解活性肽的研究已經(jīng)有20多年的歷史，目前已廣泛興起對(duì)具有免疫調(diào)節(jié)、降血壓、降血糖、降膽固醇、抗氧化、抗菌和抗病毒等生物活性的乳源活性肽產(chǎn)品的研究開(kāi)發(fā)[3]。國(guó)內(nèi)對(duì)乳清蛋白源生物活性肽的研究尚處于起步階段，尤其缺乏對(duì)乳清蛋白源抗氧化肽的研究。隨著中國(guó)乳品行業(yè)的發(fā)展，乳清蛋白的產(chǎn)量將會(huì)越來(lái)越多。盡管目前發(fā)現(xiàn)的乳清蛋白源生物活性肽段種類還比較少，并且許多生物活性肽的作用機(jī)理尚未完全闡明，但隨著研究水平的逐步深入，有目的地釋放乳清蛋白中潛在生物活性肽片段，對(duì)提高乳清蛋白產(chǎn)品的附加值，拓展乳功能性食品及新藥開(kāi)發(fā)領(lǐng)域，增進(jìn)乳的開(kāi)發(fā)與利用價(jià)值，有一定的理論指導(dǎo)意義，對(duì)人類健康事業(yè)的發(fā)展具有較大的促進(jìn)作用。

本文以乳清蛋白為原料，通過(guò)控制胰蛋白酶和胃蛋白酶的水解條件，制備出具有抗氧化活性的乳清蛋白酶解物（Whey Protein Hydrolysates，WPHs），為乳清蛋白進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用和抗氧化肽產(chǎn)品的深入研究提供科學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1 主要材料試劑

乳清蛋白（WP）：新西蘭Tatua Corporate Profile公司；胃蛋白酶、胰蛋白酶：美國(guó)Amersco公司；茚三酮：天津市北辰方正試劑廠；二苯代苦味酰基自由基DPPH：Sigma公司。

1.2 主要儀器設(shè)備

F22E型可見(jiàn)分光光度計(jì)：上海精密科學(xué)儀器有限公司；J-25型高速冷凍離心機(jī)：美國(guó)BECKMAN公司；HHS-21-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；0.01級(jí)便攜式酸度計(jì)pHB-1：廣東省醫(yī)療器械廠；JDG-0.2型真空冷凍干燥機(jī)：蘭州科近真空技術(shù)有限公司；MDF-U4086S型超低溫冷凍冰箱：日本SANYO公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 不同的酶種類對(duì)乳清蛋白酶解物抗氧化活性的影響

稱取乳清蛋白10 g溶于250 mL蒸餾水中，分別加入胃蛋白酶和胰蛋白酶啟動(dòng)反應(yīng)。水解過(guò)程中維持最適酶反應(yīng)溫度和pH并不斷攪拌（胃蛋白酶，[E/S]為0.2%，37℃，pH 2.0；胰蛋白酶，[E/S]為 0.8%，50℃，pH 7.0，分別在 0、30、60、90、120、150、180 min 取樣，調(diào) pH為 7.0，煮沸滅酶 10 min，冷卻后，4℃，4000 r/min離心20 min，取部分上清液進(jìn)行蛋白水解度的測(cè)定，其余上清液凍干后，于-20℃保存，用于抗氧化活性分析。

1.3.2 不同的[E/S]對(duì)乳清蛋白酶解物抗氧化活性的影響

分別選取胃蛋白酶的[E/S]為0.05%、0.15%、0.3%、0.45%，胰蛋白酶的[E/S]為0.1%、0.4%、1%、1.6%，按照1.3.1乳清蛋白的酶解工藝對(duì)乳清蛋白進(jìn)行酶解，測(cè)定其酶解物的抗氧化活性。

1.3.3 乳清蛋白水解度（DH）的測(cè)定

1.3.3.1 甘氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作[4]

稱取0.1000g干燥過(guò)的甘氨酸溶解后定容至100mL，取出2.0 mL定容至100 mL得20 μg/mL的溶液。取此液再分別稀釋成含量為2 μg/mL~20 μg/mL的溶液用于標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制。取2.00 mL測(cè)定用稀釋液于試管中加入1.00mL茚三酮顯色劑，混勻后沸水浴中加熱15min，同時(shí)作空白試驗(yàn)，然后冷水冷卻，加入5.0 mL 40%乙醇溶液（體積分?jǐn)?shù)）混勻，放置15 min后，以空白管調(diào)零于570 nm處測(cè)定A值。

茚三酮顯色劑：0.5 g茚三酮、0.3 g果糖、10 g磷酸氫二鈉，6 g磷酸二氫鉀定容100 mL。

1.3.3.2 乳清蛋白水解液水解度的測(cè)定[4-5]

取乳清蛋白水解液0.50mL定容至50mL，取0.50mL稀釋液于試管中并加入1.50 mL蒸餾水、1.00 mL顯色劑，混勻后置沸水浴中加熱15 min，同時(shí)作空白試驗(yàn)然后冷水冷卻，加入5.0 mL 40%乙醇溶液（v/v）混勻，放置15 min后，以空白管調(diào)零于570 nm處測(cè)定A值。

利用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算水解蛋白液中-NH2的含量（μmol/mL）。

水解度用下面公式計(jì)算：

式中：htot為每克原料蛋白質(zhì)的肽鍵毫摩爾數(shù)，查得乳清蛋白htot=8.8（mmol/g）；6.25*N為水解底物蛋白質(zhì)含（g/L），本實(shí)驗(yàn)乳清蛋白為11.66。

1.3.4 乳清蛋白酶解物抗氧化活性的測(cè)定

1.3.4.1 總還原能力的測(cè)定[6]

參考Oyaizu的方法并略作改動(dòng)。稱取乳清蛋白水解物凍干樣品樣品50mg，抗壞血酸5mg分別溶于1mL蒸餾水中，加入 2.5 mL，0.2 mol/L PBS（pH 6.6）和 2.5 mL 1%的鐵氰化鉀溶液于試管中混勻，混合物在50℃水浴中反應(yīng)20 min后，迅速冷卻并加入2.5 mL 10%的TCA，混勻后4000 r/min離心10 min，取上清液3 mL，在上清液中加入0.6 mL 0.1%的三氯化鐵溶液混勻，再加入3 mL蒸餾水搖勻，以蒸餾水調(diào)零，在700 nm處測(cè)定吸光度。吸光度值越高，說(shuō)明反應(yīng)混合物的還原性越強(qiáng)。

1.3.4.2 DPPH自由基清除能力

采用羅茲-哥特里法（Rose－Gottile）][7-8]進(jìn)行測(cè)定。

稱取50 mg樣品和5 mg抗壞血酸分別溶于2 mL水中，分別加入2 mL 0.2 mmol/L的DPPH無(wú)水乙醇溶液，混勻。室溫下避光放置30 min后，于517 nm處測(cè)定吸光值，吸光值越小，表明自由基清除能力越強(qiáng)。

式中：A0為2 mL0.2 mmol/L的DPPH無(wú)水乙醇溶液+2 mL的樣品溶劑，空白對(duì)照；Ai為2 mL無(wú)水乙醇+2 mL的樣品。

2 結(jié)果與討論

2.1 甘氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

本試驗(yàn)采用水和茚三酮法測(cè)定水解蛋自質(zhì)的水解度，如圖1為不同濃度甘氨酸溶液下對(duì)應(yīng)的吸光度值。

2.2 不同的酶種類對(duì)乳清蛋白酶解物的抗氧化活性的影響

按照1.3.1乳清蛋白的酶解工藝，將凍干的酶解物配制成50 mg/mL的樣品，測(cè)定其還原能力、DPPH自由基清除率。結(jié)果如圖2，圖3。

酶解物的抗氧化活性與某些特征氨基酸序列存在著一定相關(guān)性，但目前還沒(méi)有闡明其具體的構(gòu)效關(guān)系。在一定范圍內(nèi)，隨著水解度的增加，水解液中小分子片段越來(lái)越多，因此，可以通過(guò)控制水解度，來(lái)獲得具有生物活性的目標(biāo)片段。不同的酶對(duì)乳清蛋白中所含的各種蛋白的底物特異性及作用位點(diǎn)不同，因此獲得的酶解產(chǎn)物的肽鏈結(jié)構(gòu)和長(zhǎng)度也不同，但其活性卻有可能相同。通常期望得到的具有特定功能的活性肽往往是分子量較小的短肽。用水解度衡量水解的程度，隨水解度的增大得到的短肽相對(duì)較多。若單純追求高水解度指標(biāo)，必然會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)生較多的游離氨基酸，因此，在檢測(cè)乳清蛋白酶解物水解度的同時(shí)，應(yīng)主要檢測(cè)酶解物的抗氧化活性。

由圖2可知胃蛋白酶和胰蛋白酶酶解乳清蛋白的水解度，在2 h內(nèi)都隨時(shí)間的延長(zhǎng)而不斷增大，2 h后胰蛋白酶和胃蛋白酶水解乳清蛋白的水解度都略微下降，說(shuō)明此時(shí)大多數(shù)的乳清蛋白已經(jīng)被酶水解成許多小肽段和游離氨基酸，隨后一些游離氨基酸和小肽又發(fā)生了結(jié)合作用，使水解度產(chǎn)生降低的現(xiàn)象[4]。

由圖3可知，在2 h以內(nèi)，兩種酶的乳清蛋白水解物的總還原能力和DPPH自由基清除都隨著水解時(shí)間的延長(zhǎng)而增強(qiáng)，2 h時(shí)達(dá)到峰值，其中胰蛋白酶水解物的還原能力A值為0.498，DPPH自由基清除率為35.31%，高于胃蛋白酶水解物的還原能力（A值為0.464，DPPH自由基清26.68%）。

2.3 不同的[E/S]對(duì)乳清蛋白酶解物的抗氧化活性的影響

按照1.3.2的試驗(yàn)方法，將凍干的酶解物配制成50 mg/mL的樣品，測(cè)定其總還原能力，研究不同的加酶量對(duì)乳清蛋白酶解物的抗氧化活性的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4、圖5。

由圖4和圖5可以看出，在2 h內(nèi)，乳清蛋白的胃蛋白酶水解物和胰蛋白酶水解物的還原能力都隨時(shí)間的延長(zhǎng)而增強(qiáng)，2 h時(shí)都達(dá)到峰值，2 h后隨著水解時(shí)間的延長(zhǎng)，還原能力逐漸降低。另外，酶的添加量有一個(gè)最適的值，在底物濃度一定的時(shí)候，理論上講酶分子越多，則酶與底物之間的作用越頻繁，但隨著酶用量的增加，酶的數(shù)量就趨于過(guò)剩，單位時(shí)間內(nèi)一部分酶分子不與底物結(jié)合，造成水解度增加緩慢，另外，由于酶本身也是一種蛋白質(zhì)，也會(huì)發(fā)生酶解，如果加入量太大了則會(huì)干擾酶解物的組成和活性[9]。最終確定胃蛋白酶和胰蛋白酶水解乳清蛋白制備抗氧化產(chǎn)物的最適[E/S]分別為，[E/S]為0.15%和0.40%。

3 結(jié)論

本文研究了在不同的酶種類、[E/S]、酶解時(shí)間下，乳清蛋白酶解物的抗氧化活性。結(jié)果表明，在2 h內(nèi)，乳清蛋白的胃蛋白酶水解物和胰蛋白酶水解物的總還原能力和DPPH自由基清除能力，都隨時(shí)間的延長(zhǎng)而增強(qiáng)，2 h時(shí)都達(dá)到峰值，2 h后隨著水解時(shí)間的延長(zhǎng)，還原能力逐漸降低；另外[E/S]也有一個(gè)最適的值。最終確定，利用胃蛋白酶和胰蛋白酶分別水解乳清蛋白制備抗氧化產(chǎn)物的最佳條件為：底物及乳清蛋白液的濃度為 4%，胰蛋白酶[E/S]為 0.4%，50℃，pH 7.0，水解時(shí)間 2 h；胃蛋白酶[E/S]為 0.15%，37 ℃，pH 2.0，水解時(shí)間2 h。

[1]Pihlanto A.Antioxidative peptides derived from milk proteins[J].International dairy journal,2006,16(11):1306-1314

[2]王磊,成雪,毛學(xué)英.乳清蛋白及其活性多肽的生物學(xué)功能研究進(jìn)展[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科技導(dǎo)報(bào),2010,12(5):30-35

[3]蔣與剛,龐偉.乳清蛋白的生物學(xué)作用研究進(jìn)展[J].中國(guó)食物與營(yíng)養(yǎng),2008(10):49-51

[4]徐思源.乳清蛋白降壓肽的制備及其功能研究[D].哈爾濱:東北林業(yè)大學(xué),2007:10-11

[5]姚婷婷.乳源抗菌肽的研究[D].杭州:浙江工業(yè)大學(xué),2006:23-24

[6]Oyaizu M.Studies on products of browning reaction:antioxidative activities ofproducts ofbrowning reaction prepared from glucosamine[J].Jpn J Nutr,1986,44(6):307-315

[7]Chen H M,Muramoto K,Yamauchi.Antioxidative properties of histidine-containing peptides designed from peptide fragments found in the digest of a soybean protein[J].J agric Food Chem,1998,46(1):49-53

[8]劉志東,郭本恒,曲映紅,等.酪蛋白酶解物的抗氧化活性研究.天然產(chǎn)物研究與開(kāi)發(fā),2008,20(1):19-23

[9]劉志東.乳抗氧化肽的分離、純化及生物活性研究[D].上海:上海海洋大學(xué),2008:33-34

Antioxidant Activity of the Hydrolysates of Whey Protein

XU Nü,XI Yan-shuang,YANG Li-rong
（Food Science and Engineering College,Shanxi Agricultural University，Taigu 030801,Shanxi,China）

2012-02-29

山西農(nóng)業(yè)大學(xué)科技創(chuàng)新基金（2010009）

許女（1979—），女（漢），講師，博士，主要從事乳酸菌及功能性乳制品的研究。