響應(yīng)面法優(yōu)化Ganoderma lucidum產(chǎn)漆酶種子培養(yǎng)基

趙世光，錢森和，張 焱，蔡為榮，王 陶

（1．安徽工程大學(xué)生物與化學(xué)工程學(xué)院，安徽蕪湖 241000；2．徐州工程學(xué)院食品（生物）工程學(xué)院，江蘇徐州 221008）

響應(yīng)面法優(yōu)化Ganoderma lucidum產(chǎn)漆酶種子培養(yǎng)基

趙世光1，錢森和1，張 焱1，蔡為榮1，王 陶2

（1．安徽工程大學(xué)生物與化學(xué)工程學(xué)院，安徽蕪湖 241000；2．徐州工程學(xué)院食品（生物）工程學(xué)院，江蘇徐州 221008）

以菌絲體生物量為指標(biāo)，采用響應(yīng)面法對(duì)產(chǎn)漆酶的靈芝菌UIM281的種子培養(yǎng)基組成進(jìn)行了研究。首先采用單因素實(shí)驗(yàn)確定影響UIM281菌絲體生長(zhǎng)的碳源、氮源及無(wú)機(jī)鹽的種類和濃度范圍。在此基礎(chǔ)上，應(yīng)用Box-Behnken設(shè)計(jì)對(duì)影響菌絲體生物量的顯著因素進(jìn)行優(yōu)化，最終建立了以菌絲體生物量為響應(yīng)值的二次回歸方程模型，獲得了最適的菌絲體增殖種子培養(yǎng)基。結(jié)果表明，在VB10.1g/L的條件下最佳種子培養(yǎng)基組成為：玉米粉18.0g/L，豆餅粉12.3g/L，MgSO4·7H2O 1.8g/L，在28℃，150r/min條件下振蕩培養(yǎng)6d后，可獲得24.18g/L菌絲體，可為漆酶發(fā)酵培養(yǎng)提供質(zhì)優(yōu)量大的接種體。

靈芝菌，漆酶，種子培養(yǎng)基，優(yōu)化，響應(yīng)面法

Abstract：Targeting on mycelial biomass，response surface methodology（RSM） was applied to study the seeding medium components of UIM281，a Ganoderma lucidum strain producing laccase.Firstly，the categories and concentration scales of carbon source，nitrogen sources and inorganic salt affecting the growth of UIM281 mycelium were confirmed by single factor experiments.Based on this result，Box-Behnken design was used to optimize significant factors affecting mycelial biomass.Finally，the second-order equation model for mycelial biomass of UIM281 was established and seeding medium suitable to mycelial proliferation was obtained.The results showed when VB1was prior designated 0.1g/L，the optimal composing for seeding medium was as following：18.0g/L of corn flour，12.3g/L of soybean powder，1.8g/L of MgSO4·7H2O.When cultivated at 28℃and 150r/min for 6d，24.18g/L of biomass was obtained，which provided the excellent inoculum for the laccase fermentation.

Key words：Ganoderma lucidum；laccase；seed medium；optimization；response surface methodology

漆酶是一種含銅的多酚氧化酶，在食品加工、造紙、廢水處理等方面具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。靈芝菌（Ganoderma lucidum）除富含多糖、三萜類和肽類等有效生物活性成分外，也是產(chǎn)漆酶的重要真菌。在真菌漆酶發(fā)酵領(lǐng)域，高產(chǎn)菌株的選育、發(fā)酵工藝及產(chǎn)酶條件的優(yōu)化已開展了很多研究[1-2]。漆酶發(fā)酵培養(yǎng)主要采用兩種接種方式：一是采用從斜面或平板上挑取菌片直接接入發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行漆酶發(fā)酵[3-4]，二是采用經(jīng)種子擴(kuò)培后再接入發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行產(chǎn)酶[5-6]；兩類研究的重點(diǎn)多集中在發(fā)酵培養(yǎng)基及誘導(dǎo)產(chǎn)酶培養(yǎng)工藝的優(yōu)化[7-8]。而真菌漆酶是在生產(chǎn)菌株菌絲體生長(zhǎng)良好后被誘導(dǎo)分泌的次級(jí)代謝產(chǎn)物，在規(guī)模化發(fā)酵生產(chǎn)中，第一種接種方式會(huì)延長(zhǎng)菌株在發(fā)酵培養(yǎng)基中的適應(yīng)時(shí)間，造成部分營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)被菌絲體生長(zhǎng)而消耗，導(dǎo)致產(chǎn)酶時(shí)間推遲，發(fā)酵周期延長(zhǎng)。而將斜面菌株經(jīng)種子培養(yǎng)基增殖擴(kuò)培后再接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，則可實(shí)現(xiàn)生產(chǎn)菌株生長(zhǎng)期和生產(chǎn)期的分離，可有效避免這種缺陷。響應(yīng)面法（RSM）能夠在有限的次數(shù)內(nèi)，對(duì)影響生物過(guò)程的關(guān)鍵因子及其交互作用進(jìn)行優(yōu)化、評(píng)價(jià)，以獲得影響過(guò)程的最佳條件，已成功應(yīng)用于種子培養(yǎng)基以及發(fā)酵條件的優(yōu)化[9-10]。本研究室利用離子注入手段選育出一株漆酶高產(chǎn)靈芝菌突變株UIM281，本文對(duì)影響UIM281菌絲體生長(zhǎng)、增殖的碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽種類及其濃度范圍進(jìn)行考察，采用響應(yīng)面法對(duì)其營(yíng)養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，以期獲得能夠擴(kuò)培出菌球均一、菌絲體生物量大的液體種子培養(yǎng)基，為進(jìn)一步漆酶發(fā)酵提供質(zhì)優(yōu)量大的接種體，為漆酶工業(yè)化發(fā)酵提供基礎(chǔ)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

菌種 靈芝菌UIM281由本實(shí)驗(yàn)室選育，4℃條件下保存于PDA斜面；斜面培養(yǎng)基（g/L） 馬鈴薯200，葡萄糖20，瓊脂18，pH7.0；液體基礎(chǔ)培養(yǎng)基（g/L） 葡萄糖20，蛋白胨10，KH2PO41，VB10.1，pH 6.0。

SHB-III循環(huán)水真空泵；TU-1800紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)；HZQ-F160恒溫?fù)u床；ZK-82A型電熱真空干燥箱；TGLL-18K臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)；LDZX-40高壓滅菌鍋。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 種子搖瓶培養(yǎng) 從靈芝菌斜面切取黃豆粒大小菌塊點(diǎn)種于PDA平板中心，28℃培養(yǎng)5～7d，至菌絲體長(zhǎng)滿2/3平板，挑選生長(zhǎng)良好的平板，用打孔器切取直徑1cm菌塊3塊，接入已裝有50mL液體培養(yǎng)基的250mL錐形瓶中，于28℃，150r/min的條件下按照種子培養(yǎng)基優(yōu)化設(shè)計(jì)方案進(jìn)行6d振蕩培養(yǎng)。

1.2.2 生物量測(cè)定[11]種子培養(yǎng)結(jié)束后，經(jīng)兩層紗布過(guò)濾，再經(jīng)真空泵抽濾獲得菌絲體，60℃恒溫烘至恒重，電子天平稱重，測(cè)得菌絲體生物量。

1.2.3 種子培養(yǎng)基優(yōu)化

1.2.3.1 單因素實(shí)驗(yàn) 分別以不同濃度的碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽代替基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的葡萄糖、蛋白胨、KH2PO4，按照種子搖瓶培養(yǎng)條件進(jìn)行6d振蕩培養(yǎng)后，測(cè)定菌絲體生物量，考察單因素對(duì)種子生長(zhǎng)的影響，并確定相應(yīng)的濃度范圍。

1.2.3.2 Box-Behnken設(shè)計(jì) 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定最佳碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽及其相應(yīng)濃度范圍后，以玉米粉（X1）、豆餅粉（X2）和MgSO4·7H2O（X3）三個(gè)因素為自變量，以菌絲體生物量（Y）為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)三因素三水平的Box-Behnken實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)因素及水平見(jiàn)表1。

表1 Box-Behnken設(shè)計(jì)因素與水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken design

2 結(jié)果與討論

2.1 不同營(yíng)養(yǎng)條件對(duì)靈芝菌種子培養(yǎng)生物量的影響

2.1.1 碳源對(duì)生物量的影響 從圖1可以看出，除茶餅粉外，其他碳源對(duì)UIM281菌絲體生長(zhǎng)均有一定的促進(jìn)作用，以多糖類碳源的促進(jìn)作用最為明顯。以玉米粉為碳源，當(dāng)其濃度為25g/L時(shí)生物量最高，繼續(xù)提高其濃度不會(huì)對(duì)菌絲體生長(zhǎng)產(chǎn)生顯著效果（圖2）。玉米粉作為一種遲效碳源，在菌絲體生長(zhǎng)過(guò)程中可被逐漸分解、利用，其蛋白質(zhì)、維生素和礦物質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)成分全面，可作為種子增殖培養(yǎng)的適宜碳源。茶餅粉中雖然含有35%～40%的多糖，但其內(nèi)含的皂素、多酚等物質(zhì)對(duì)微生物的生長(zhǎng)不利，這可能抑制了菌絲體增殖，不適合作為UIM281碳源使用。

圖1 不同碳源對(duì)生物量的影響Fig.1 Effect of different carbon sources on the biomass

圖2 玉米粉濃度對(duì)生物量的影響Fig.2 Effect of corn flour concentration on the biomass

2.1.2 氮源對(duì)生物量的影響 從圖3可以看出，UIM281對(duì)有機(jī)氮源的利用效果明顯優(yōu)于無(wú)機(jī)氮源，以豆餅粉效果最佳，蛋白胨、酵母膏次之。低濃度豆餅粉對(duì)菌絲體生長(zhǎng)促進(jìn)作用明顯，當(dāng)其濃度高于15g/L后，生物量基本保持恒定（圖4）。同時(shí)觀察到，培養(yǎng)基中過(guò)高濃度的豆餅粉可導(dǎo)致培養(yǎng)液粘稠，抑制了規(guī)則狀菌球的形成，出現(xiàn)大團(tuán)狀結(jié)塊，不利于溶氧。豆餅粉中的氨基酸種類和含量較豐富，且價(jià)格低廉，以其作為適宜的氮源，其濃度不宜超過(guò)20g/L。

圖3 不同氮源對(duì)生物量的影響Fig.3 Effect of different nitrogen sources on the biomass

圖4 豆餅粉濃度對(duì)生物量的影響Fig.4 Effect of soybean power concentration on the biomass

2.1.3 無(wú)機(jī)鹽對(duì)生物量的影響 圖5表明，與K+相比，Mg2+有利于UIM281菌絲體的生長(zhǎng)，而Cu2+、Fe2+、Mn2+則抑制菌絲體增殖。Mg2+與生物量呈現(xiàn)一定程度的濃度依賴性，低濃度時(shí)對(duì)菌絲體生長(zhǎng)有促進(jìn)作用，高濃度則明顯抑制菌絲體生長(zhǎng)，當(dāng)濃度為1.5g/L時(shí)，可獲得最高生物量。所以，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中，選擇Mg2+做優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。

圖5 不同無(wú)機(jī)鹽對(duì)生物量的影響Fig.5 Effect of different inorganic salt on the biomass

圖6 鎂離子濃度對(duì)生物量的影響Fig.6 Effect of Mg2+concentration on the biomass

2.2 響應(yīng)面設(shè)計(jì)優(yōu)化種子培養(yǎng)基

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確定玉米粉、豆餅粉和MgSO4·7H2O作為影響U281生物量的關(guān)鍵因素，以生物量為指標(biāo)，設(shè)計(jì)響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 響應(yīng)面設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Design and results for RSM

運(yùn)用SAS軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行回歸擬和，獲得生物量對(duì)培養(yǎng)基中的玉米粉、豆餅粉和MgSO4濃度的多元二次回歸方程。

Y=24.84-1.54125X1-6.48125X2-1.0775X3-4.88375X12+4.3475X1X2-8.84875X22-0.385X2X3-5.47125X32-7.395X1X3

二次模型方差分析（表3）表明，回歸模型Pr＞F=0.000564，失擬項(xiàng)Pr＞F=0.166038，表明模型回歸極顯著，失擬不顯著；該模型的一次項(xiàng)、二次項(xiàng)對(duì)生物量的影響均達(dá)到極顯著水平，交互項(xiàng)對(duì)生物量影響也顯著?；貧w方程多元相關(guān)系數(shù)為0.9842，表明98.42%的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的變異性可用此回歸模型來(lái)解釋，模型與實(shí)際情況擬合得很好，可以用此方程代替真實(shí)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。通常情況下變化系數(shù)（CV）越低，實(shí)驗(yàn)的精確度和可信度越高，CV值等于12.82%，表明Box-Behnken實(shí)驗(yàn)的可信度和精確度較好；精密度是有效信號(hào)與噪聲的比值，大于4.0視為合理，本實(shí)驗(yàn)精密度達(dá)到15.047。

表3 二階回歸方程方差分析Table 3 Analysis of variance for quadratic regression eqution

二次模型中回歸系數(shù)顯著性檢驗(yàn)（表4）表明，X2對(duì)生物量的線性效應(yīng)極顯著，而X1和X3不顯著；X12、X22、X32對(duì)生物量的曲面效應(yīng)均達(dá)到極顯著；X1和X2，X1和X3對(duì)生物量的交互影響極顯著。以上分析表明實(shí)驗(yàn)因素對(duì)響應(yīng)值的影響不是單純的線性關(guān)系，彼此存在交互作用。

表4 二階回歸方程系數(shù)顯著性檢驗(yàn)Table 4 Regression coefficients and their significances tests for quadratic eqution

2.3 菌絲體生物量的響應(yīng)面分析

將X1、X2、X3三個(gè)參數(shù)分別固定，Y指標(biāo)隨其余的兩個(gè)參數(shù)變化趨勢(shì)分別如圖7～圖9所示。

圖7Y=f（X1，X2）的響應(yīng)面分析Fig.7RSM analysis for Y=f（X1，X2）

圖7表明，在選定的實(shí)驗(yàn)水平范圍內(nèi)，生物量指標(biāo)較高值落在X1、X2較低水平范圍，表明豆餅粉與玉米粉濃度較低時(shí)可獲得較高的生物量；繼續(xù)提高二者濃度則不利于菌絲體生長(zhǎng)，生物量均呈現(xiàn)逐步減少的趨勢(shì)。在等高線圖中，沿X2軸向等高線變化密集，而X1軸向等高線的變化相對(duì)稀疏，故豆餅粉對(duì)生物量峰值的影響大于玉米粉，是影響生物量的主要效應(yīng)因子。

圖8Y=f（X1，X3）的響應(yīng)面分析Fig.8RSM analysis for Y=f（X1，X3）

圖8顯示了豆餅粉處于中心水平時(shí)，玉米粉與MgSO4·7H2O對(duì)生物量的交互影響。從等高線圖可以看出X1、X3二因素間的交互作用較顯著，因?yàn)榈雀呔€的形狀反映交互效應(yīng)的強(qiáng)弱大小，橢圓形等高線表示二因素交互作用顯著[12]。生物量隨MgSO4·7H2O與玉米粉濃度的增加都呈現(xiàn)逐步增加的趨勢(shì)；到達(dá)最高極值點(diǎn)后生物量不再顯著增加，這表明繼續(xù)增大培養(yǎng)基中玉米粉和MgSO4·7H2O的濃度，不會(huì)對(duì)菌絲體的生長(zhǎng)產(chǎn)生顯著的促進(jìn)效果。

圖9Y=f（X2，X3）的響應(yīng)面分析Fig.9RSM analysis for Y=f（X2，X3）

圖9表明，隨著豆餅粉濃度的增加，生物量呈現(xiàn)先增大后降低的趨勢(shì)；而MgSO4·7H2O濃度的增加對(duì)生物量不構(gòu)成顯著影響，其對(duì)應(yīng)的生物量只在小幅范圍變化。從圖中等高線與坐標(biāo)軸的交點(diǎn)數(shù)可見(jiàn)，豆餅粉對(duì)生物量的影響遠(yuǎn)大于MgSO4·7H2O，是主要的影響因素。

由以上分析可知，豆餅粉對(duì)生物量有極顯著影響，這與方差分析（表4）的結(jié)果一致。對(duì)回歸方程中X1、X2和X3求一階偏導(dǎo)并使其等于零，得到響應(yīng)面穩(wěn)定極值點(diǎn)對(duì)應(yīng)的培養(yǎng)基參數(shù)：X1=-0.69815，X2=-0.54627，X3=0.39256，即玉米粉18g/L，豆餅粉12.3g/L，MgSO4·7H2O 1.8g/L，此時(shí)理論生物量達(dá)到26.94g/L。采用上述最優(yōu)條件配制種子培養(yǎng)基，實(shí)際獲得3組平行實(shí)驗(yàn)生物量的平均值為24.18g/L，與理論預(yù)測(cè)值相差不大，說(shuō)明該模型對(duì)響應(yīng)值的預(yù)測(cè)性很好。

3 結(jié)論

首先采用單因素實(shí)驗(yàn)確定了適合UIM281菌絲體生長(zhǎng)的廉價(jià)適宜的碳源、氮源及無(wú)機(jī)鹽，分別為玉米粉、豆餅粉和MgSO4·7H2O，并分別確定了各自的適宜濃度范圍。在此基礎(chǔ)上采用響應(yīng)面法建立了以菌絲體生物量為響應(yīng)值的全變量二次回歸模型，在VB10.1g/L的條件下，得到了UIM281種子培養(yǎng)的優(yōu)化條件：玉米粉18g/L，豆餅粉12.3g/L，MgSO4·7H2O 1.8g/L，在28℃，150r/min條件下振蕩培養(yǎng)6d后，獲得24.18g/L菌絲體，且菌絲體呈較規(guī)則球狀，大小較均一，為下一步的產(chǎn)漆酶發(fā)酵提供優(yōu)良的接種體奠定了良好基礎(chǔ)。

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Optimization of the seed medium for laccase-producing strain Ganoderma lucidum by response surface methodology

ZHAO Shi-guang1，QIAN Sen-he1，ZHANG Yan1，CAI Wei-rong1，WANG Tao2
（1.Biochemical Engineering College of Anhui Polytechnic University，Wuhu 241000，China；2.Food and Bio-engineering Department of Xuzhou Engineering College，Xuzhou 221008，China）

TS201.2+5

A

1002-0306（2012）16-0232-05

2011－12－12

趙世光（1977-），男，博士，副教授，研究方向：微生物酶工程、農(nóng)產(chǎn)品加工副產(chǎn)物高值化利用。

安徽省高校省級(jí)自然科學(xué)研究項(xiàng)目（KJ2011B025）；安徽工程大學(xué)引進(jìn)人才科研啟動(dòng)基金（2007YQQ007）；安徽省科技廳國(guó)際科技合作計(jì)劃項(xiàng)目（10080703035）。