人工養(yǎng)殖暹羅鱷血清血漿及白細胞提取物體外抗菌活性研究

崔小冬，歐陽召，王春梅，賡 迪

北京中醫(yī)藥大學中藥學院生物制藥系，北京 100102

隨著鱷魚人工養(yǎng)殖的成功，其價值得到多方面的開發(fā)，包括旅游觀賞、餐飲加工、時裝皮具等，自1999年Sharbanay報道海水鱷血清有抗菌活性以來，國外、國內(nèi)已有多位學者對不同種鱷魚的血漿、白細胞等進行了抗菌抗病毒方面的研究［1-7］，結(jié)果顯示鱷魚血清或白細胞對部分革蘭氏陽性菌(G+)、革蘭氏陰性菌(G-)有抑制效果，如鏈球菌、大腸桿菌、志賀桿菌、綠膿桿菌等。其中泰國科學家研究發(fā)現(xiàn)暹羅鱷新鮮血清能抑制革蘭氏陰性菌包括產(chǎn)氣腸桿菌ATCC 13048、大腸埃希菌ATCC 25922、肺炎克雷伯菌ATCC 27736、鼠傷寒沙門氏菌ATCC 13311和銅綠假單胞菌ATCC 27853，也抑制新型隱球菌250309和黑曲霉，然而不抑制革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌(S.aureus)、化膿性鏈球菌(S.pyogenes)、枯草芽孢桿菌(B.subtilis)、白色念珠菌(C.albicans)和隱球菌(C.neoformans)［8］。暹羅鱷白細胞提取物能夠抑制綠膿桿菌(Psudomonas aeruginosa)、傷寒桿菌(Salmonella typhi)、霍亂弧菌(Vibrio cholerae)、巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)、表皮葡萄球菌(Staphylococus epidermidis)和白色念珠菌(Candida albicans)［9］。那么，人工養(yǎng)殖的暹羅鱷血是否具有抗菌活性呢?本實驗從以上文獻結(jié)論出發(fā)選取G-大腸桿菌、綠膿桿菌;G+金黃色葡萄球菌進一步驗證人工養(yǎng)殖暹羅鱷血樣品的抗菌效果，另外選取白色念珠菌來觀察其對真菌是否有作用，為進行鱷魚血抗菌方面產(chǎn)品開發(fā)提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 鱷魚血的來源

人工養(yǎng)殖暹羅鱷(Crocodylus siamensis)血來源于海南三亞龍虎園養(yǎng)殖場，有林業(yè)局批準的野生動物馴養(yǎng)繁殖許可，由北京洪源澳達投資有限公司提供。取血方法為活體固定后竇動脈取血，鱷魚不進行麻醉。

1.1.2 菌株來源和培養(yǎng)

大腸桿菌 (Escherichia coli DH5α)、綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、白色念珠菌(Candida albicans)購自中科院微生物研究所菌種室。大腸桿菌、綠膿桿菌和金黃色葡萄球菌的培養(yǎng)選用LB培養(yǎng)基，白色念珠菌選用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，固體培養(yǎng)基含1.2%的瓊脂。上述LB、牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基適于紙片法、平板菌落計數(shù)法，打洞法所用培養(yǎng)基在高壓滅菌并冷卻至45～50 ℃［1，9］，加入不同菌種不同濃度菌液后定量倒入平皿制成。

1.2 方法

1.2.1 鱷魚血成分的制備方法

1.2.1.1 鱷魚血清的制備方法

獲得的鱷魚血液，盛于離心管中，靜置促其凝固，待血液凝固后，將其平衡后離心(3000 rpm，10 min)，得到的上清液即為血清，可小心將上清吸出(注意切勿吸出細胞成分)，分裝備用。第一個濃度為原液，第二個濃度為2倍稀釋，第三個濃度為4倍稀釋，以生理鹽水稀釋。

1.2.1.2 鱷魚血漿的制備

在盛血的離心管中先加入一定比例抗凝劑溶液(3.2%枸櫞酸鈉)，再將血液加入(抗凝劑溶液:血液 =1∶9)后，立即連續(xù)搖動，充分混合，配平后離心(離心3000 rpm，離心5～10 min)，所得的上清液即為血漿［10］。血漿濃度第一個濃度為原液，后兩個稀釋濃度同血清，沉淀用于制備白細胞提取物。

1.2.1.3 鱷魚血白細胞提取物的制備方法

用生理鹽水洗滌離心制備血漿后的沉淀一次，倒盡上清液，恢復至4 mL，即為全血細胞懸液(包括紅細胞和所有白細胞)。白細胞懸液制備:取0.2 mL全血細胞懸液，加蒸餾水2 mL，在冰水中輕輕吹打1 min，再加1.8%氯化鈉溶液2 mL，混勻，再加生理鹽水至滿，離心沉淀，棄上清液，即為0.2 mL的白細胞懸液［11］。超聲波破碎懸液中的白細胞，并加入等體積10%的乙酸溶液，4℃下震蕩(250 rpm)2 h，低溫高速離心收集上清液，真空冷凍干燥，用0.01%醋酸溶液溶解即為白細胞提取物［9］。用Bradford法測定白細胞提取物的總蛋白含量。牛血清白蛋白標準品用于制作標準曲線。第一個樣品濃度為總蛋白200 μg/mL，后2個濃度為倍比稀釋濃度，同血清，血漿。

1.2.2 鱷魚血成分的抑菌實驗方法

氨芐西林鈉50 ug/mL溶液作為抗金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌的陽性藥;青霉素、鏈霉素的雙抗溶液作為抗大腸桿菌的陽性藥;稱取一定量的達克寧膏劑，加入三倍量的注射用水稀釋成乳劑作為抗白色念珠菌的陽性藥。血清與血漿的空白對照為生理鹽水，白細胞提取物的空白為0.1%乙酸溶液。

1.2.2.1 紙片法

將固體斜面保存菌種接入液體培養(yǎng)基進行活化，置震蕩培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)18～24 h至吸光度值達 0.5 左右(細菌測 OD600，真菌測 OD595)［1，9］，得新的增菌液;藥敏紙片的制備:通過打孔器將定性濾紙制成6 mm的圓片，經(jīng)高壓滅菌烘干備用。每紙片分別滴上鱷魚血清、血漿、白細胞提取物、陽性對照藥液以及相應空白對照5 uL，超凈臺里風干待用;將菌液150 uL加到LB固體平板上，用無菌不銹鋼涂布棒涂布均勻，將三個不同濃度的鱷魚血組分樣品的風干藥敏紙片、陽性及空白紙片貼于同一菌培養(yǎng)基平板上，倒置，37℃培養(yǎng)18～24 h，觀察細菌生長情況，測量抑菌環(huán)，每個成分的每個濃度設置3個重復，取平均值。

1.2.2.2 打孔法

將LB培養(yǎng)基高壓滅菌并冷卻至45～50℃，將298 mL培養(yǎng)基與2 mL增菌液在滅菌燒杯中充分混勻，用無菌玻璃注射器迅速抽取30 mL含菌培養(yǎng)基，注入直徑為9 cm的平皿中，接種針挑破氣泡，靜置使凝固［9］;用內(nèi)徑為5 mm立式打孔器打孔至底部，平皿中心打一孔，距邊緣對稱打四孔，用洗耳球?qū)⒖字泄腆w吸出;分別取三個不同濃度的鱷魚血組分、陽性及空白溶液30 uL(白細胞提取物含總蛋白200 μg/mL)加入到同一含菌培養(yǎng)基平板上的5個洞中，待液體擴散后倒置，37℃培養(yǎng)18～24 h，觀察細菌生長情況，測量抑菌環(huán)，每個成分的每個濃度設置3個重復，取平均值。

1.2.2.3 平板計數(shù)法［1］

取不同菌株16～18 h的增菌液，用無菌生理鹽水調(diào)其吸光度值為0.5，記為100，取100菌液30 uL加入到270 uL無菌生理鹽水中，混勻為10-1，倍比稀釋至10-7。取1.5 mL無菌離心管，每管分別加入400 uL生理鹽水后，各組每管分別對應加入50 uL血清、血漿、白細胞提取物、空白對照、陽性藥溶液混勻，置震蕩培養(yǎng)箱37℃ 培養(yǎng)1 h，將管中混合液加到LB固體平板上，用無菌不銹鋼涂布棒涂布均勻，倒置，37℃ 培養(yǎng)18～24 h觀察結(jié)果，統(tǒng)計各樣品對各菌株各濃度菌液存活百分率，每個濃度設置3個重復，取平均值。

1.2.3 統(tǒng)計處理

2 結(jié)果

本研究采用三種常用的檢測樣品抗菌活性的方法:紙片法，打孔法和菌液稀釋平板計數(shù)法。在紙片法和打孔法的測試中所有樣品對所有菌種都不表現(xiàn)出抗菌活性，陽性對照藥表現(xiàn)出很好的抗菌活性，結(jié)果見表1。

表1 紙片法測定鱷魚血清血漿及白細胞提取物對四種菌的抑菌環(huán)直徑大小(mm)Table 1 Inhibition effects of the crocodile serum plasma and white blood cell extracts on the four kinds of microbe by the paper disk diffusion method(mm)

由于打孔法和紙片法均為陰性結(jié)果，本文以下數(shù)據(jù)為通過平板計數(shù)法獲得，檢測了鱷魚血清對大腸桿菌、綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌的抑制效果。

2.1 鱷魚血液組分對大腸桿菌的抑制效果

采用菌液稀釋平板計數(shù)法分別檢測鱷魚血清、血漿和白細胞提取物對大腸桿菌的抑制作用，以青霉素和鏈霉素的雙抗作為陽性對照。結(jié)果表明鱷魚血清和血漿有一定的抑制大腸桿菌生長的效果，血清效果強于血漿，但程度較陽性藥弱(見表2)。

表2 鱷魚血液各組分對大腸桿菌不同濃度菌液存活百分率(%)的影響Table 2 Effects of samples on livability(%)of Escherichia coli DH5α

2.2 鱷魚血液組分對金葡菌的抑制效果

采用菌液稀釋平板計數(shù)法分別檢測鱷魚血清、血漿和白細胞提取物對金葡菌的抑制作用，以青霉素作為陽性對照。結(jié)果表明鱷魚血清血漿和白細胞提取物都有一定的抑制金葡菌生長的效果，樣品中抑制程度以白細胞提取物效果最好，其次是血清樣品，但程度仍然較陽性藥弱(見表3)。

表3 鱷魚血液組分對各金葡菌不同濃度菌液存活百分率(%)的影響Table 3 Effects of samples on livability(%)of Staphylococcus aureus

本實驗室采用菌落平板計數(shù)法還檢測了鱷魚血清、血漿及白細胞提取物對綠膿桿菌和白色念珠菌的抑制效果，結(jié)果表明鱷魚的血液組分對這兩種菌均無作用。

3 討論

本實驗采用三種抑菌試驗方法進行活性檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)通過紙片法多次重復性實驗及陽性對照實驗，顯示鱷魚血的血清、血漿和白細胞提取物對以上四種菌無明顯的抗菌能力，其原因可能是抗菌成分為大分子類，被紙片吸附后無法擴散出去抑制菌類產(chǎn)生抑菌環(huán)。經(jīng)打洞法驗證，鱷魚血清、血漿和白細胞提取物也無明顯抗菌效果，可能是打洞法作為紙片法的衍生方法，去除了紙片對液體成分的吸附，但大分子仍無法穿越孔四周的瓊脂層而出現(xiàn)抑菌現(xiàn)象。用菌落計數(shù)法發(fā)現(xiàn)鱷魚血的血清和血漿對大腸桿菌和金葡菌有抑制作用，鱷魚血白細胞提取物對金葡菌有一定抑制作用。抑菌實驗方法的選擇對實驗結(jié)果影響很大，對于含蛋白類抗菌成分的活性測定較適宜的方法采用菌落計數(shù)法較好。

本實驗室的結(jié)果與文獻報道有差別，鄒黎黎等［2］試驗結(jié)果證明來源于廣州市番禺香江野生動物鱷魚公園的暹羅鱷血白細胞提取物可以抑制金葡菌和大腸桿菌的增殖，本實驗室所制備的白細胞提取物對金葡菌有抑制作用，但對大腸桿菌無效。國外學者［5］對暹羅鱷白細胞提取物的抗菌活性篩選結(jié)果是白細胞提取物能夠抑制金葡菌的生長，不能抑制大腸桿菌和綠膿桿菌生長，與本實驗室結(jié)果一致，另外，他們發(fā)現(xiàn)白色念珠菌對鱷血白細胞提取物敏感［5］，本實驗室樣品不具有對白色念珠菌的抑制活性。各個實驗室的結(jié)果存在差異的原因可能是樣品來源不同(本實驗室的鱷魚血為活體取血所得，并沒有對鱷魚進行麻醉，這與多數(shù)實驗室的取血方式不同)，處理方式不同(血細胞的制備方法稍有差別，本實驗采用收集全血細胞后破裂紅細胞的方法得到白細胞，鄒黎黎［2］等直接從血液中取白膜層狀細胞制備白細胞)，抗菌有效成分未保留到相應的組分中或已經(jīng)被破壞無法復性;別的原因可能是抗菌成分是補體系統(tǒng)［12］激發(fā)的，該動物體內(nèi)通常不含大量的強抗菌成分，取樣時也未大量產(chǎn)生。

雖然鱷魚血中含有抗菌成分，但本研究表明鱷魚血的多成分混合液抗菌活性弱于陽性對照，另外，鱷魚血的抗菌活性具有熱不穩(wěn)定、溫度依賴性、對蛋白酶敏感等特點［7］，如果鱷魚血不經(jīng)純化直接制備成抗菌產(chǎn)品，可能沒有意義。目前國外仍在深入研究鱷魚血的抗菌活性成分，最近，他們利用反相高效液相色譜的方法從白細胞提取物中分離得到四種抗菌肽，抗菌活性遠遠高于粗提物，研究仍在進行［13-15］，最終有可能將來通過基因工程生產(chǎn)。

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