兩株脂肪類混合細菌拆分縮水甘油丁酸酯的工藝研究

黃 強，孟慶意，牛柏林，張 蕊，高瑩玉

(鄭州大學化工與能源學院，河南鄭州450001)

0 引言

縮水甘油丁酸酯是重要的手性藥物中間體，在藥物、液晶、農藥和生物探針等領域中應用［1］.國內的研究者對其進行了相關的研究［2-3］和報道［4-5］，但鮮有兩株脂肪類細菌拆分縮水甘油丁酸酯的研究報道.據(jù)市場估計，手性化合物將會帶來巨大的市場價值［6］，歐美等國把手性化合物研究作為戰(zhàn)略研究的一部分.手性藥物的拆分和合成的方法主要有［8］：酶法合成、萃取、膜法以及生物催化制備等.筆者通過最適產酶條件下工藝研究，得到(R)-縮水甘油丁酸酯的對映體過量值(ee)達到92%，轉化率為83.2%.

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

土樣來源：鄭州大學校園內和周邊餐館土壤.縮水甘油丁酸酯是由環(huán)氧氯丙烷和正丁酸鈉合成，并對照紅外光譜圖與標準圖譜，兩者一致，經氣相色譜儀(GC98OO，中國上?？苿?chuàng)色譜儀器有限公司)測定，含量在99%以上，為無色黏性液體;旋光儀(上海物理光學儀器廠，WZZ-2S型);配制培養(yǎng)基所用的試劑為化學純，其它的試劑為分析純.

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗中使用的培養(yǎng)基

土壤富集培養(yǎng)基：(NH4)2SO42.0 g，NH4NO32.0 g，MgSO4·7H2O 0.16 g，KH2PO40.32 g，NaCl 0.5 g，大豆油 5.0 mL，蒸餾水 250 mL，pH=9.0.

平板分離培養(yǎng)基：大豆油10 mL，(NH4)2SO42.0 g，NH4NO32.0 g，MgSO4·7H2O 0.16 g，KH2PO40.32 g，瓊脂 4.0 g，CaCO31 g，NaCl 0.5 g，蒸餾水 250 mL，pH=7.0.

細菌種子液培養(yǎng)基：大豆油 5mL，(NH4)2SO42.0 g，NH4NO32.0 g，MgSO4·7H2O 0.16 g，KH2PO40.32 g ，NaCl 0.5 g，蒸餾水 250 mL，pH=9.0.

種子液拆分培養(yǎng)基：淀粉1.5 g，牛肉膏3 g，KH2PO41 g，NaCl 0.5 g，蒸餾水400 mL，pH 自然.

1.2.2 細菌富集的方法

稱5 g土樣加入有20 mL滅菌水(蒸汽滅菌器滅菌)的試管中，搖動后取5 mL懸浮液加入盛有30 mL富集培養(yǎng)基的三角燒瓶中，35℃，搖瓶120 r/min振蕩3 d后，取5 mL培養(yǎng)液至另一個盛有新培養(yǎng)基的三角燒瓶中繼續(xù)振蕩培養(yǎng)3 d.富集3次，然后進行平板分離.

1.2.3 平板分離的方法

先將平板分離培養(yǎng)基滅菌后冷卻至60℃，倒入平板內，再將經富集培養(yǎng)的細菌液用無菌水進行適當稀釋(本實驗采用10-4和10-5兩個稀釋度)，并取0.5 mL涂布于分離平板上，在35℃下，細菌培養(yǎng)3 d，由于平板培養(yǎng)基中有CaCO3，微生物產生的脂肪酶與大豆油作用后會生成脂肪酸與CaCO3發(fā)生作用，產生透明圈，生成的脂肪酸越多透明圈就越大，然后將透明圈較大的細菌菌落挑至斜面培養(yǎng)基上保存.

1.2.4 細菌培養(yǎng)的方法

細菌種子培養(yǎng)：從斜面菌種接種一環(huán)至裝液30 mL的250 mL三角瓶中，在30℃，轉速200 r/min下進行搖床振蕩培養(yǎng).

細菌菌液培養(yǎng)：待種子培養(yǎng)24 h后，取1 mL的接種量接種于裝液有60 mL的500 mL的三角瓶中，在30℃，轉速200 r/min下進行48 h的搖床振蕩培養(yǎng).

1.2.5 脂肪菌催化拆分縮水甘油丁酸酯的方法

取30 mL的菌液，加入標準的苯二甲酸氫鉀緩沖液調節(jié)pH，再加入0.5 g的底物，調節(jié)好溫度，200 r/min振蕩反應，可得到拆分產物與細菌液的混合液.

1.2.6 細菌酶活的測定

測定方法：取250 mL三角瓶，加入5 mL緩沖液和6 mL底物乳化液，在35℃恒溫水浴中預熱10 min，加入1 mL待測樣品液，迅速搖勻并保溫計時，反應30 min后立即加入體積分數(shù)為95%的乙醇10 mL終止酶作用，加入2滴1%酚酞指示劑，用經過標定的0.02 mol/L的NaOH溶液滴定至微紅色，并記錄耗堿量.對照樣品先經過乙醇的滅活酶后同樣處理.

脂肪酶活力［9］定義：在30℃，pH=7.0下催化水解橄欖油，每分鐘產生1 μmol的脂肪酸的酶量定義為1個單位(U).本實驗所測定的脂肪類細菌的酶活為1.5 U.

1.2.7 縮水甘油丁酸酯含量的測定

利用氣相色譜儀(GC98OO，中國上?？苿?chuàng)色譜儀器有限公司，SE-30為填充柱填料，填充柱：3 mm×1.5 m.熱導檢測儀和進樣溫度為：230℃，柱溫：130℃;氫氣流量：40 mL/min.柱前后壓：0.05 mPa.)測定縮水甘油丁酸酯的含量.

1.2.8 (R)-縮水甘油丁酸酯的光學純度的測定

將30 mL的三氯甲烷加入到混合液中，萃取并離心破乳，用分液漏斗分離.用旋光儀(上海物理光學儀器廠，WZZ-2S型)測定液體的旋光度∝，求出比旋光值［α］(［α］=L=1.5 dm)對映體過量值 ee=100%(［α］最大為31°).

2 實驗結果與討論

2.1 篩選拆分縮水甘油丁酸酯的細菌

采集校園和餐館周邊經常接觸油脂類的土樣15個，經土樣富集培養(yǎng)和平板分離，可以得到變色圈大小不同的群落，結果如表1所示.

表1 細菌培養(yǎng)基菌落特點Tab.1 feature of bacteria colony culture

表1中10-4，10-5分別表示細菌的兩個稀釋度.“+”表示培養(yǎng)基中存在透明圈不大的菌落，且菌落不是很多;“++”表示有較明顯的透明圈，菌落個數(shù)一般;“+++”表示培養(yǎng)基有較多的菌落，且有較大的透明圈;“-”表示培養(yǎng)基中沒有出現(xiàn)透明圈的菌落，或者幾乎很少.

由表1 可知 1，3，4，7，8，10，11，12，13，15 號土樣在細菌培養(yǎng)基中長出了透明圈的菌落，從中說明這些菌能分解酯產生脂肪酸，從中挑選產酶能力較強的菌，保存至斜面.

2.2 細菌脂肪酶活力的測定

將有“+”，“++”和“+++”的單菌株重新進行培養(yǎng)，測定其酶活.結果如表2所示.

從中選擇 1(2)，3(3)，3(4)，3(5)，3(8)，7(5)，10(2)，13(3)，15(1)，8(2)等 10 種菌株進行下一步的培養(yǎng)和細菌篩選.利用縮水甘油丁酸酯培養(yǎng)測量酶活，從中選擇3(3)和13(3)兩株進行混合培養(yǎng).

2.3 優(yōu)化考察拆分縮水甘油丁酸酯產生菌的條件

分別考察碳源、氮源、pH、溫度、振蕩速率、裝液量等因素條件，培養(yǎng)3 d，如圖1～6和表3所示.從圖1～圖6分析得出，淀粉為碳源，牛肉膏為氮源，初始pH=8.0，溫度30℃，轉速200 r/min，搖瓶2 d，裝液量50 mL，產酶量最佳.

表2 細菌酶活測定結果Tab.2 Result of enzymatic activity

2.4 混合菌拆分縮水甘油丁酸酯工藝條件的研究

2.4.1 反應過程中最佳pH工藝的選擇

據(jù)篩選實驗方法，反應溫度定為30℃，搖床振蕩速率為200 r/min，底物量為0.5 g，不同pH(5.5，6.0，6.5，7.0，7.5)條件下細菌催化拆分縮水甘油丁酸酯，反應12 h后，測定縮水甘油丁酸酯的轉化率及(R)-縮水甘油丁酸酯的ee值，其結果如圖7所示.當pH=6.0時，雙菌的立體拆分最佳，產物ee值達到了89.8%，縮水甘油丁酸酯的轉化率為84.6%;在pH范圍內，轉化率在65.1% ～84.6%，ee值在23.8% ～89.8%.

表3 培養(yǎng)細菌各個因素條件Tab.3 Every effected factor of bacteria medium

圖7 pH值對于對映體過量值(ee)的影響Fig.7 Effect of pH on ee

2.4.2 反應過程中最佳溫度工藝的選擇

在pH=6.0，轉速200 r/min下，在底物加入量為0.5 g，拆分12 h下，試驗在不同溫度下(26，28，30，33，35℃)的縮水甘油丁酸酯轉化率和ee值，其結果如圖8所示.當反應溫度在28℃時，兩株細菌有較好的拆分效果，ee值達到82.3%.試驗溫度范圍內，轉化率在78.2% ～83.9%之間，ee值在51.7% ～82.3%.

圖8 溫度對于對映體過量值(ee)的影響Fig.8 Effect of temperature on ee

2.4.3 反應過程中最佳底物量工藝的選擇

在28℃，拆分12 h，200 r/min下，試驗在30 mL細菌液中加入不同底物量(0.3，0.5，0.8，1.0，1.2，1.4 g)對拆分反應的影響，其結果如圖9所示.當?shù)孜锪繛?.5時，ee值為82.3%;底物0.3 g時，轉化率為98.8%，ee值為75.4%，隨著底物量的增加，縮水甘油丁酸酯的轉化率降低，范圍為 60% ～83.7%，ee值范圍為 25.1% ～82.3%.

圖9 底物量對于對映體過量值(ee)的影響Fig.9 Effect of substrate amounts on ee

2.4.4 最佳反應時間工藝的選擇

在28℃ ，底物量0.5 g，pH=6.0，轉速200 r/min 下，試驗不同的反應時間(5，7，12，15，20 h)對拆分反應的影響，如圖10所示.當反應5 h時，縮水甘油丁酸酯轉化率為65.7%，ee值為25.3%;隨著反應時間的延長，ee值逐漸提高，在12 h時產物ee值最高達到92.8%，轉化率為83.2%，在反應20 h時，ee值為74.3%.

圖10 反應時間對于對映體過量值(ee)的影響Fig.10 Effect of reaction time on ee

2.4.5 最佳反應振蕩速率工藝的選擇

在28℃，pH=6.0，拆分12 h，底物量0.5 g下，試驗不同的振蕩速率(160，180，200，210，220 r/min)對拆分反應的影響，其結果如圖11所示.兩株細菌拆分縮水甘油丁酸酯反應的轉化率和立體選擇性與反應振蕩速率的相關性很小，縮水甘油丁酸酯轉化率在83.1% ～85.5%，ee值在80.6% ～92%，以200 r/min為最佳.

圖11 振蕩速率對于對映體過量值(ee)的影響Fig.11 Effect of rotating rate on ee

2.4.6 最佳反應條件的試驗

在28 ℃，pH=6.0，轉速200 r/min，拆分12 h下，底物量0.5 g，測定了縮水甘油丁酸酯的轉化率和ee值，其結果為ee值達到92.8%，轉化率達到83.2%.

3 結論

由于從土壤篩選出的十幾個單株細菌拆分效果不理想，從中優(yōu)選出兩株脂肪類細菌混合使用，拆分效果良好，經文獻［10］方法鑒定為：短桿菌屬和霉菌，篩選工藝為：淀粉為碳源，牛肉膏為氮源，初始pH=8.0，溫度30℃，轉速200 r/min，搖瓶2 d，裝液量50 mL，產酶量最佳，為1.5 U，未進行誘變.工藝條件為：28℃，pH=6.0，30 mL脂肪類雙菌液中加入0.5 g縮水甘油丁酸酯，在振蕩12 h，轉速200 r/min下，拆分效果良好，(R)-縮水甘油丁酸酯的對映體過量值(ee)為92.8%，轉化率為83.2%，拆分效果良好，操作工藝簡單，可以用于研究和后續(xù)的開發(fā)應用.

［1］HANSON R M.The synthetic methodology of nonracimic glycidol and related 2，3-epoxy alcohol［J］.Chem Rev，1994，91(4)：437-475.

［2］鄒小明，錢俊青.酵母細胞催化拆分縮水甘油丁酸酯的工藝研究［J］.浙江工業(yè)大學學報，2005，33(1)：106-108.

［3］王陽，許健和.縮水甘油丁酸酯的對應選擇性酶促水解［J］.華東理工大學學報，1999，25(2)：209-211.

［4］孟慶意，黃強，班春蘭，等.縮水甘油丁酸酯拆分的研究進展［J］.化學工程與裝備，2011(1)：129-131.

［5］黃強，孟慶意，班春蘭，等.氣相色譜法測定縮水甘油丁酸酯［J］.光譜實驗室，2011，28(5)：2448-2450.

［6］俞小鷗，張傳華.醫(yī)藥中間體最新市場［J］.精細與專用化學品，2006(10)：8-11.

［7］孫萬儒.手性化合物和手性藥物的酶法合成［J］.藥物生物技術，1996，4(3)：239-245.

［8］田曉強，冀克儉.手性化合物的萃取分離研究進展［J］.化學分析計量，2005，14(5)：63-65.

［9］VORDEW ULBECKE T.Comparision of lipase by different assays［J］.Enzyme Microb Technol，1992，14：631-638.

［10］蔡謹，岑沛霖.工業(yè)微生物學［M］.北京：化學工業(yè)出版社，1999.