維甲酸聯(lián)合低濃度化療藥物對肺腺癌A549細(xì)胞的作用

趙俊剛，任開明，湯雋，張磊

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院胸外科，沈陽 110004）

肺癌是世界上發(fā)病率和死亡率增長最快，預(yù)后最差的惡性腫瘤之一，化療是治療肺癌的重要手段，遺憾的是，傳統(tǒng)的大劑量、長間歇化療模式在治療肺癌的同時也產(chǎn)生了嚴(yán)重的不良反應(yīng)，許多患者不能耐受或是對化療藥物耐藥而導(dǎo)致化療失敗。近年來對于腫瘤誘導(dǎo)分化劑的研究越來越受到學(xué)者的重視，特別是全反式維甲酸（all-trans retinoic acid，RA）具有的強(qiáng)大誘導(dǎo)分化能力，不僅在治療急性早幼粒細(xì)胞白血病方面取得了良好的臨床效果［1，2］，而且能夠抑制多種腫瘤細(xì)胞的生長。因此被認(rèn)為是一類很有希望的抗癌防癌藥物［3，4］。誘導(dǎo)分化劑與低濃度化療藥物聯(lián)合應(yīng)用有希望顯著減少藥物的劑量，降低化療藥物的毒性，增強(qiáng)療效。在本實驗中，我們采用全反式維甲酸和低于臨床用藥濃度不同劑量的化療藥物吉西他濱、順鉑等及2者聯(lián)合處理A549人肺腺癌細(xì)胞株，觀察不同藥物、不同劑量及不同作用時間對A549細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期的影響。

1 材料與方法

1.1 材料及細(xì)胞培養(yǎng)

A549人肺腺癌細(xì)胞株由中國醫(yī)科大學(xué)中心實驗室饋贈。A549細(xì)胞接種于含10%小牛血清、青霉素 100 U/mL 和鏈霉素 100 μg/mL、pH 7.10～7.12的RPMI1640培養(yǎng)液中，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，反復(fù)傳代，培養(yǎng)至實驗所需數(shù)量。

1.2 藥物配制及實驗分組

全反式維甲酸（RA）貯存液：溶于95%乙醇中配成10.0 mmol/L貯存液，實驗前用培養(yǎng)液稀釋。各組乙醇順鉑、吉西他濱等藥物濃度設(shè)計參照臨床用藥劑量。藥物順鉑濃度依不同要求分別為0.10、0.41、0.83、3.30、33.00 mg/L （分別標(biāo)記為 D1、D2、D3、D4、D5）；吉西他濱濃度分別為 1.0、4.1、8.3、33.0、330.0 mg/L（分別標(biāo)記為 G1、G2、G3、G4、G5）。

1.3 MTT方法檢測細(xì)胞增殖

培養(yǎng)細(xì)胞經(jīng)過常規(guī)胰酶消化后，接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔（200 μL）5×104個細(xì)胞，于實驗結(jié)束前4 h，加入 5 mg/mL MTT 10 μL/孔，繼續(xù)培養(yǎng) 4 h，棄上清，加入DMOS 200 μL/孔，待MTT代謝產(chǎn)物Fomrazan完全溶解后，用酶標(biāo)比色儀（美國）測定各孔OD值（490 nm），每組重復(fù)4～6孔。MTT OD值與癌細(xì)胞接種數(shù)目之間有良好線性關(guān)系，同時也能反映細(xì)胞的代謝活力，并以此反映體外試驗中化療藥物對細(xì)胞的殺傷效果。細(xì)胞抑制率（%）=（1-實驗組OD值/對照組OD值）×100%。

1.4 流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞周期時相

貼壁培養(yǎng)細(xì)胞常規(guī)消化，使之成為單細(xì)胞懸液，將約5×105～1×106個細(xì)胞移入離心管中，800～1 000 r/min離心5 min，PBS洗2次，800～1 000 r/min離心5 min，棄上清后，在離心管中留約0.5 mL PBS，將細(xì)胞混勻，加70%乙醇到細(xì)胞懸液中，迅速混勻，置4℃8 h以上，然后800～1 000 r/min離心5～10 min，去乙醇，加適量PBS重懸細(xì)胞，800～1 000 r/min，洗1次，留 0.4 mL PBS，重懸細(xì)胞，加人 RNase 5 μL（10 μg/mL），37℃，1 h，再加PIl（100 μg/mL），以流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞時相。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 最佳RA濃度及時機(jī)的篩選

對于維甲酸（RA）最佳濃度及時機(jī)的篩選如圖所示，我們考查其針對A549細(xì)胞的抑制率，當(dāng)維甲酸與化療藥物作用A549細(xì)胞8 h后再加入聯(lián)合作用抑制效果最佳，抑制率達(dá)到30%（圖1），而當(dāng)維甲酸濃度＞5 μmol/L后各組抑制率差別不大，基本在16%～19%之間（圖2），究其原因可能與受體飽和度有關(guān)。

2.2 維甲酸對化療的增效作用

在維甲酸對化療的增效作用的研究中，我們發(fā)現(xiàn)：吉西他濱濃度在1.0 mg/L、4.1 mg/L時維甲酸的增效作用并不明顯（19.6%和26.8%），進(jìn)一步加大濃度可見抑制率上升明顯（38.1%～64.0%），吉西他濱臨床用藥濃度組的抑制率和維甲酸聯(lián)合吉西他濱1/10臨床用藥濃度組差別不大（圖3），而維甲酸聯(lián)合每一個順鉑濃度組在抑制率的比較上都有一定程度的提升（14.6%～71.8%），維甲酸聯(lián)合順鉑1/10臨床用藥濃度組甚至比順鉑單藥臨床用藥濃度抑制率高（圖 4）。

2.3 維甲酸及化療藥物對細(xì)胞周期的影響

流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示，維甲酸主要作用于A549細(xì)胞的G1期和S期。順鉑對細(xì)胞周期的影響主要是將細(xì)胞阻滯在G1期，減少S期細(xì)胞，而維甲酸可明顯促進(jìn)順鉑對細(xì)胞周期的影響。吉西他濱對細(xì)胞周期的影響主要為對S期的阻滯，加入維甲酸后S期比例并無明顯變化，僅僅增加了G1期的比例。

3 討論

在肺癌的治療中，無論是否接受手術(shù)治療，化療都是重要的治療手段之一，但是傳統(tǒng)的大劑量細(xì)胞毒化療模式主要是針對腫瘤細(xì)胞的增殖失控設(shè)計的。這些療法靶向性差，因此在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時，也會對正常細(xì)胞產(chǎn)生殺傷效應(yīng)，而導(dǎo)致諸如骨髓抑制、消化道反應(yīng)等嚴(yán)重毒副作用，而且在機(jī)體可能承受的條件下，難以從根本上徹底清除患者體內(nèi)的腫瘤細(xì)胞，總體化療有效率不高。1988年，上海維甲酸協(xié)作組首先使用全反式維甲酸（ATRA）誘導(dǎo)分化治療人急性早幼粒細(xì)胞白血病獲得顯著療效。這一結(jié)果和研究工作的不斷深入，誘導(dǎo)分化作為惡性腫瘤的一種新型治療方法已日益引起醫(yī)學(xué)工作者的關(guān)注和興趣。其對肺癌的防治作用，也越來越受到廣大學(xué)者的重視。有研究證實［5～7］，ATRA能抑制肺癌細(xì)胞的快速增殖，誘導(dǎo)其分化和凋亡，降低肺癌細(xì)胞的體外侵襲能力。本實驗研究觀察了聯(lián)合應(yīng)用維甲酸和不同濃度的化療藥物對肺腺癌A549細(xì)胞的作用，發(fā)現(xiàn)維甲酸可以顯著提高肺癌細(xì)胞對化療藥物的敏感性，確保抑制率的同時減少用藥量，減少化療藥物的毒副反應(yīng)，提高患者對化療的耐受性。

維甲酸直接抑制腫瘤細(xì)胞的生長同時亦調(diào)整細(xì)胞周期，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的同步化療作用。細(xì)胞周期中G1期主要合成RNA和核糖體，該期特點是物質(zhì)代謝活躍，迅速合成RNA和蛋白質(zhì)，細(xì)胞體積顯著增大。這一期的主要意義在于為下階段S期的DNA復(fù)制做好物質(zhì)和能量的準(zhǔn)備，S期為DNA合成期，G1期的增高和S期的減少導(dǎo)致細(xì)胞周期延遲或阻滯，DNA合成發(fā)生障礙，從而抑制A549細(xì)胞生長、代謝、增殖，最終觸發(fā)凋亡機(jī)制，導(dǎo)致細(xì)胞死亡。吉西他濱通過抑制DNA合成發(fā)揮細(xì)胞毒作用，作為細(xì)胞周期特異性藥物，吉西他濱主要作用于DNA合成期（S期）。在一定的條件下，也可以阻止G1期向S期的進(jìn)展，對G2和M期無作用［8］。而順鉑為細(xì)胞周期非特異性藥物，主要抑制RNA及蛋白質(zhì)合成，阻滯細(xì)胞于G1期。流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示維甲酸主要作用于A549細(xì)胞的G1期和S期，它通過調(diào)節(jié)多種腫瘤細(xì)胞周期相關(guān)蛋白表達(dá)，阻止癌細(xì)胞G1/S期進(jìn)程，抑制癌細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡［9］，聯(lián)合順鉑時促進(jìn)了對S期的阻滯，而與吉西他濱聯(lián)合作用時除保持對S期的阻滯作用外，還加強(qiáng)了對G1期的阻滯。

肺腺癌對放療、化療敏感性均較差，聯(lián)合使用維甲酸誘導(dǎo)分化治療，可增加化療有效率，延長患者的生存期，而不明顯地破壞其機(jī)體的免疫機(jī)制與造血、肝腎等功能，提高患者的生存質(zhì)量。

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