響應(yīng)面法優(yōu)化新疆脹果甘草多糖的提取工藝

劉文玉，顏雪琴，林祥群，魏長(zhǎng)慶

(1.新疆石河子職業(yè)技術(shù)學(xué)院，新疆石河子832000;2.石河子大學(xué)食品學(xué)院，新疆石河子832000)

甘草(Glycyrrhiza spp.)為豆科甘草屬多年生草本植物，是新疆荒漠區(qū)最主要的植被物種之一，分布面積廣、貯量大，其性甘、平，具有清熱解毒、健脾補(bǔ)氣、潤(rùn)肺止咳之功效，民間用于治療乳腺炎、胃及十二指腸潰瘍、慢性氣管炎、咳嗽、氣喘、慢性咽喉炎、食物中毒等癥［1］。甘草多糖(GPS)為甘草重要的活性成分之一［2］，具有抗補(bǔ)體和促有絲分裂等免疫調(diào)節(jié)作用［3］，尤其是免疫活性、抗氧化活性以及抗腫瘤活性都與其含量密切相關(guān)［4］。新疆甘草中以脹果甘草(Glycyrrhiza inflata Bat.)資源最豐富，產(chǎn)量居全國(guó)之冠，是新疆商品甘草的最主要來(lái)源，主要分布在新疆天山以南的和田、喀什、阿克蘇、巴音郭楞和哈密等地。2008年兵團(tuán)農(nóng)三師獲得國(guó)家農(nóng)業(yè)開(kāi)發(fā)土地治理項(xiàng)目“新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)農(nóng)業(yè)三師1萬(wàn)hm2人工甘草基地”建設(shè)項(xiàng)目，至2011年甘草人工種植甘草面積已經(jīng)達(dá)到1萬(wàn) hm2［5-7］。目前，甘草多糖的研究報(bào)道較多，而針對(duì)采用響應(yīng)面優(yōu)化方法研究新疆脹果甘草多糖的研究報(bào)道較少。張琳［8］、趙春建等［9］、王航宇［10］等研究超聲波提取溫度、提取時(shí)間、液固比等因素對(duì)甘草多糖提取率的影響，并優(yōu)化了提取條件。因此，通過(guò)對(duì)脹果甘草多糖的提取尋找新的具有高活性的甘草多糖仍然是多糖研究領(lǐng)域的一大重點(diǎn)和熱點(diǎn)課題［11］。本實(shí)驗(yàn)以新疆脹果甘草多糖提取率為響應(yīng)值，在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，進(jìn)行提取溫度、提取時(shí)間和料液比的中心組合實(shí)驗(yàn)，擬合出多元線性回歸方程，以獲得新疆脹果甘草多糖提取的最佳工藝及其參數(shù)，為脹果甘草多糖的提取加工提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新疆脹果甘草(Glycyrrhiza inflata Bat.)購(gòu)于新疆石河子市農(nóng)貿(mào)市場(chǎng);無(wú)水乙醇、石油醚、硫酸、苯酚、葡萄糖等 均為分析純。

MNMF-1818型谷物粉碎機(jī) 湖北碧山機(jī)械有限公司;T6型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 湘儀集團(tuán);RE52-2旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海滬西分析儀器廠有限公司;722型可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司;FA1004A電子天平 上海精天電子儀器有限公司;微量加樣器 上海大龍醫(yī)療設(shè)備有限公司;SSY型電熱恒溫水浴鍋 北京泰克儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 基本工藝流程

1.2.1.1 粉碎、脫脂 甘草干品粉碎后過(guò)40目篩，按料液比1∶5(g∶mL)用石油醚回流脫脂1h，重復(fù)1次。

1.2.1.2 脫糖 將脫脂后的甘草粉末自然風(fēng)干后，按料液比1∶5用80%乙醇溶液回流2h，重復(fù)1次，濾渣60℃烘干，蒸餾水90℃水提2h，將每次提取過(guò)濾所得的水提母液合并，濃縮至合適體積，使用玻璃透析袋流水透析3d。

1.2.1.3 脫蛋白 將濃縮液用15%三氯乙酸在4℃下攪拌脫蛋白。溶液經(jīng)離心去沉淀，清液以1mol/L NaOH中和至中性，再流水透析3d。

1.2.1.4 濃縮 袋內(nèi)溶液濃縮至適當(dāng)體積，加入4倍于糖溶液體積的80%乙醇在4℃過(guò)夜沉淀并用80%乙醇清洗。

1.2.1.5 收集沉淀 離心收集沉淀，經(jīng)乙醇和無(wú)水丙酮依次洗滌三次后冷凍干燥得到粗多糖。

1.2.2 脹果甘草多糖含量測(cè)定方法 采用苯酚硫酸法，參照參考文獻(xiàn)［4-5］。

1.2.4 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精確量取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液 0.4、0.8、1.2、1.6、2.0mL，置于標(biāo)有 1、2、3、4、5號(hào)的干燥試管中并加水至2.0mL，再加入5%苯酚溶液1.0mL，搖勻，然后加濃硫酸(95.5%)5.0mL，充分搖勻，放置10min，沸水浴20min，同時(shí)設(shè)蒸餾水為空白對(duì)照，以上述確定波長(zhǎng)進(jìn)行掃描測(cè)定，測(cè)定其吸光度值，以濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.5 甘草多糖提取條件的確定 依據(jù)參考資料［2，5，10］，取 過(guò) 40 目 篩 的 甘 草 粉 末 1g，提 取 時(shí) 間60min、料液比為 10∶1(mg∶L)、提取溫度為 80℃為初始工藝參數(shù)，考察料液比(5∶1、10∶1、15∶1、20∶1、25∶1)、提取時(shí)間(30、50、70、90、110min)、提取溫度(50、60、70、80、90、100℃)對(duì)脹果甘草多糖提取率的影響。

1.2.6 中心組合實(shí)驗(yàn) 在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，選取料液比、提取時(shí)間和提取溫度進(jìn)行中心組合實(shí)驗(yàn)，并結(jié)合實(shí)際實(shí)驗(yàn)條件選取合理水平。以多糖提取率(Y)為響應(yīng)值，并與建立的回歸方程給出的預(yù)測(cè)值(Y＇)比較，通過(guò)響應(yīng)面分析及對(duì)提取條件進(jìn)行優(yōu)化。中心組合實(shí)驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)如表1所示。

表1 中心組合設(shè)計(jì)因素與水平表Table 1 Factors and levels in the central composite design

2 結(jié)果與討論

2.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

葡萄糖的波長(zhǎng)掃描圖見(jiàn)圖1。以λmax=475nm作為甘草多糖的最大吸收波長(zhǎng)。在λmax=475nm處測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為y=0.0465x-0.007(R2=0.9992)的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖2。

圖1 葡萄糖的波長(zhǎng)掃描圖Fig.1 Scan map of glucose wave length

圖2 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve of glucose

2.2 不同因素對(duì)脹果甘草多糖提取率的影響

提取時(shí)間對(duì)甘草多糖提取效果的影響如圖3所示。在提取時(shí)間為70～90min時(shí)提取率較高，超過(guò)90min，脹果甘草提取率有所下降，考慮到浸提時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，有可能引起提取物結(jié)構(gòu)的變化，同時(shí)可能會(huì)產(chǎn)生副產(chǎn)物，影響其功能性質(zhì)，因此，選擇提取時(shí)間75min，進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn);提取溫度對(duì)甘草多糖提取效果的影響如圖4所示，提取溫度由50℃增加到90℃時(shí)，脹果甘草多糖提取隨溫度的上升而上升，當(dāng)溫度超過(guò)90℃后繼續(xù)提高溫度提取率變化不大，因此，選擇90℃進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn);不同料液比對(duì)甘草多糖提取效果的影響如圖5所示，脹果甘草多糖提取率隨料液比的增大而增加，當(dāng)料液比大于20∶1時(shí)，提取率不再增加，因此，選擇料液比為20∶1進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

2.3 中心組合實(shí)驗(yàn)

圖3 提取時(shí)間對(duì)甘草多糖提取率的影響Fig.3 Effect of time on extraction

圖4 提取溫度對(duì)甘草多糖提取率的影響Fig.4 Effect of temperature on extraction

圖5 料液比對(duì)甘草多糖提取率的影響Fig.5 Effect of ratio of solid to liquid on extraction

響應(yīng)面設(shè)計(jì)的Box-Benhnken法具有實(shí)驗(yàn)次數(shù)少、精度高、預(yù)測(cè)性好等優(yōu)點(diǎn)，常用于因素水平的優(yōu)化。依據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以料液比、提取時(shí)間和提取溫度作為主要因素，設(shè)計(jì)三因素三水平響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)。共有15個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)，其中12個(gè)為析因子，3個(gè)為零點(diǎn)。零點(diǎn)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3次，以估計(jì)誤差。中心組合實(shí)驗(yàn)方案及結(jié)果如表2所示。

表2 中心組合實(shí)驗(yàn)方案及結(jié)果Table 2 Central composite design matrix and experimental results

以脹果甘草多糖提取率為響應(yīng)值，通過(guò)SAS統(tǒng)計(jì)軟件的響應(yīng)面回歸方程對(duì)表2數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析(表3)，建立多糖提取率(Y)的二次響應(yīng)面回歸模型，回歸方程為:

回歸方程的相關(guān)系數(shù)R2=0.9854，模型與實(shí)際擬合較好。模型的F值為37.54，p＜0.01，說(shuō)明回歸模型方程顯著;CV值僅為0.57，說(shuō)明實(shí)驗(yàn)操作可信。綜上所述，此回歸方程可用于脹果甘草多糖提取率的預(yù)測(cè)。

根據(jù)回歸方程，分別繪制其中一個(gè)因素固定于零水平的條件下另外兩個(gè)因素之間的響應(yīng)曲面圖，如圖6所示。

表3 多糖提取率的二次多項(xiàng)回歸模型方程方差分析Table 3 Analysis of variances for the established Radix Glycyrrhiza ploysacchride yield

圖6 各因素對(duì)甘草多糖提取率影響的響應(yīng)面圖Fig.6 Response surface plots for polysaccharide extraction ratio in the function of different parameters

2.4 最佳提取條件及實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷尿?yàn)證

通過(guò)軟件分析得到的最大的響應(yīng)值為10.59%，即脹果甘草多糖最大提取率為10.59%，與之對(duì)應(yīng)的提取條件為:溫度 92.4℃，時(shí)間 83.3min，料液比20.8∶1?？紤]到實(shí)際操作的便利性，采用溫度93℃，時(shí)間83min，料液比為21∶1為優(yōu)化條件，進(jìn)行3組重復(fù)實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明:模型得到最優(yōu)條件下脹果甘草多糖實(shí)際平均提取率為10.48%，與預(yù)測(cè)的理論值相接近，說(shuō)明模型有效且能夠較好地反映出脹果干草多糖的提取條件，同時(shí)也說(shuō)明了用響應(yīng)面法優(yōu)化脹果甘草多糖的提取條件是可行的。本實(shí)驗(yàn)所提取脹果甘草多糖主要為粗多糖，經(jīng)測(cè)算其純度為34.96%，與張琳［8］等提取的甘草多糖的純度相比純度較低，主要可能與甘草品種的不同有關(guān)，另外本實(shí)驗(yàn)未采用超聲輔助提取也會(huì)對(duì)脹果甘草多糖的提取率及純度產(chǎn)生影響，因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)需要進(jìn)一步純化，并且考慮采用其他方式如超聲波、微波輔助提取，以期提高脹果甘草多糖提取率及純度。

3 結(jié)論

在單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的基礎(chǔ)上，對(duì)新疆脹果甘草多糖的提取條件進(jìn)行了三因素三水平的響應(yīng)面設(shè)計(jì)，建立了響應(yīng)值和各個(gè)因素之間的數(shù)學(xué)模型，依據(jù)此數(shù)學(xué)模型確定的最佳提取工藝為溫度93℃，時(shí)間83min，料液比21∶1。在上述最佳提取條件下，脹果甘草多糖提取率的實(shí)驗(yàn)值為10.48%。模型方差分析和響應(yīng)面的分析表明，該模型回歸極顯著，對(duì)實(shí)驗(yàn)擬合較好，對(duì)油新疆脹果甘草多糖提取的工業(yè)化有一定應(yīng)用價(jià)值。

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