反膠束法提取紅蕓豆蛋白的前萃工藝優(yōu)化

任海偉，陳曉沛，張 飛，邢超紅，李 雪，陳海秀

(1.蘭州理工大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅蘭州730050;2.甘肅圣源麗水環(huán)保科技有限公司，甘肅蘭州730030)

蕓豆(Phaseolus vulgaris Linn.sp.)學(xué)名菜豆，是普通菜豆(如小黑蕓豆、小白蕓豆等)和多花菜豆(如圓奶華蕓豆 H、N、D、X 等)的總稱(chēng)，屬豆科(Leguminosae)菜豆屬(Phaseolus L.)的小宗雜糧作物。蕓豆具有極高的營(yíng)養(yǎng)和藥用價(jià)值，蛋白含量20.29%～27.73%，脂肪含量1.02%～2.03%，VC含量1.88～1.96mg/100g，VB1含量 3.52mg/100g，VB2含量2.87mg/100g，Ca、Fe含量分別是雞肉的7倍和4倍。中醫(yī)理論記載，蕓豆味甘平，性溫，具有溫中下氣、利腸胃、止呃逆、益腎補(bǔ)元?dú)獾裙π?。研究表明，蕓豆含有花色苷、皂苷等有效成分，能提高人體非特異性免疫，增強(qiáng)抗病能力，激活淋巴T細(xì)胞，抑制腫瘤細(xì)胞發(fā)展，受到醫(yī)學(xué)界的廣泛重視［1］。蕓豆蛋白富含天門(mén)冬氨酸、谷氨酸、精氨酸和亮氨酸等氨基酸，其氨基酸評(píng)分、化學(xué)評(píng)分和必需氨基酸指數(shù)均高于大豆蛋白或乳清蛋白，必需氨基酸組成符合FAO/WHO標(biāo)準(zhǔn)模式，是一種優(yōu)質(zhì)植物蛋白［2］。蕓豆蛋白的等電點(diǎn)為4.7，相對(duì)分子質(zhì)量約90.5～17.5ku，其貯藏蛋白主要是清蛋白(11.5%～31%)和球蛋白(46%～81%)［3-4］。蕓豆蛋白具有緊湊的空間構(gòu)象和較高的熱穩(wěn)定性，二級(jí)結(jié)構(gòu)包括螺旋結(jié)構(gòu)(16.5%)、β-類(lèi)結(jié)構(gòu)(52.2%)和無(wú)規(guī)則卷曲(31.0%)等［5］。反膠束是將表面活性劑溶解在非極性有機(jī)溶劑中，并使其濃度超過(guò)臨界濃度，碳?xì)滏溝蛲?，親水基向內(nèi)組成，形成極性核內(nèi)含有一定數(shù)量水的“微水池”，此“微水池”具有能夠溶解蛋白質(zhì)和氨基酸等極性物質(zhì)的能力，是熱力學(xué)穩(wěn)定和透明體系［6］。反膠束溶液作為新的溶劑系統(tǒng)萃取分離技術(shù)，主要基于液-液相轉(zhuǎn)移，具有萃取條件溫和、產(chǎn)品純度高、易保持物質(zhì)活性等優(yōu)點(diǎn)，常用于蛋白質(zhì)、氨基酸、酶、細(xì)胞色素、生物堿等生物活性大分子的分離，在食品工業(yè)領(lǐng)域有良好的應(yīng)用前景［7］。為充分利用紅蕓豆資源，本文擬考察AOT/異辛烷反膠束體系的含水量和穩(wěn)定性，并通過(guò)探討表面活性劑AOT濃度、緩沖液pH、KCl濃度和萃取時(shí)間等因素對(duì)紅蕓豆蛋白(RKBP)前萃率的影響，研究RKBP的反膠束萃取條件，以期獲得較佳的前萃工藝條件，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)紅蕓豆雜糧資源提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

選取無(wú)霉變、籽粒飽滿(mǎn)的紅蕓豆，經(jīng)去皮、粉碎、烘干后過(guò)100目篩得到蕓豆粉(以干基計(jì)，蛋白質(zhì)含量20.4%)，備用。二-(2-乙基已基)琥珀酸酯磺酸鈉(C20H37O7Na，AOT，純度 ＞99%)上海邦成化工有限公司;牛血清白蛋白 上海普飛生物技術(shù)公司;考馬斯亮藍(lán)(G-250)上海吉如生物科技發(fā)展有限公司;異辛烷、氯化鉀等試劑 均為分析純。

DDS-11A數(shù)字電導(dǎo)率儀 上海太普儀器有限公司;UV-9200紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 北京瑞利分析儀器公司;XH-C漩渦混合器 江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠;GZX-9240MBE數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;TG16-WS臺(tái)式高速離心機(jī)湘儀離心機(jī);SHZ-82氣浴恒溫振蕩器 江蘇榮華儀器制造有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 反膠束體系含水量(W0)的研究 預(yù)先配制不同濃度的AOT/異辛烷溶液，在磁力攪拌器高速攪拌下用微量注射器向AOT/異辛烷溶液中逐漸加入去離子水，待攪拌均勻后測(cè)試溶液電導(dǎo)率。根據(jù)W0=H2O的質(zhì)量/AOT的質(zhì)量，計(jì)算W0，繪制W0與電導(dǎo)率的關(guān)系曲線，確定各濃度條件下的臨界含水量(Wc)。研究臨界增溶水量(對(duì)應(yīng)于Wc的水體積)與AOT濃度之間的關(guān)系，確定反膠束體系穩(wěn)定的AOT 濃度范圍［8］。

1.2.2 反膠束體系的制備 準(zhǔn)確稱(chēng)取一定質(zhì)量AOT放入錐形瓶中，加入10mL異辛烷，磁力攪拌使其完全溶解，然后向溶液中加入1mL具有一定離子濃度和pH的KCl緩沖液，振蕩器中振蕩2h后5000r/min離心 20min，溶液若透明則為反膠束，反之則不是［9-10］。本實(shí)驗(yàn)用NaH2PO4-Na2HPO4緩沖體系調(diào)節(jié)KCl緩沖液濃度和pH。

1.2.3 反膠束法提取PKBP的前萃工藝 取一定體積1.2.2中配制的反膠束溶液置于錐形瓶中，準(zhǔn)確稱(chēng)取0.500g紅蕓豆粉加入反膠束體系中。以180r/min速度30℃恒溫振蕩一段時(shí)間，振蕩后所得混合物轉(zhuǎn)移至離心管8000r/min離心20min，得到前萃液。測(cè)定前萃液體積和前萃液中的蛋白質(zhì)含量(以萃取前

分別研究 AOT 濃度 (0.25、1.00、1.25、1.50、2.00mol/L)、緩沖液 pH(6.0、6.5、7.0、7.5、8.0)、KCl濃度(0、0.05、0.10、0.25、1.00 mol/L)和萃取時(shí)間(30、60、90、120、150min)4 個(gè)因素對(duì) PKBP 前萃率的影響。在單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上，選取影響較為顯著的AOT濃度、緩沖液pH和KCl濃度3個(gè)因素進(jìn)行L9(34)正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化前萃條件，因素水平表見(jiàn)表1。的反膠束溶液作為空白樣)，按照公式(1)計(jì)算前萃率［10］。

表1 因素與水平表Table 1 Factors and levels of the orthogonal tests

2 結(jié)果與分析

2.1 AOT/異辛烷反膠束體系含水量(W0)的研究

反膠束體系是若干個(gè)納米級(jí)大小的“微水池”，通過(guò)調(diào)節(jié)含水量(W0)即可改變反膠束的水池尺寸，進(jìn)而使親水性物質(zhì)通過(guò)螯合作用進(jìn)入“微水池”，達(dá)到萃取目的。W0越大則有機(jī)相所形成的反膠束微粒的直徑越大，萃取能力越強(qiáng)。由圖1可知，不同AOT濃度的反膠束體系，電導(dǎo)率均隨含水量的增大而緩慢增加，當(dāng)含水量增大到臨界含水量(Wc≈55)時(shí)，電導(dǎo)率突然迅速增大。這是因?yàn)?，?dāng)含水量較小時(shí)，水被油相包圍在內(nèi)核中，水相與油相之間是表面活性劑層，此時(shí)溶液的導(dǎo)電主要由被表面活性劑包裹的水核的運(yùn)動(dòng)和油相的導(dǎo)電所引起，所以電導(dǎo)率較小;當(dāng)含水量逐步增加時(shí)，水核長(zhǎng)大，間距變小，水核的運(yùn)動(dòng)和碰撞加劇導(dǎo)致電導(dǎo)率緩慢增加;當(dāng)含水量超過(guò)Wc時(shí)，將會(huì)增強(qiáng)水與界面相作用，破壞反膠束結(jié)構(gòu)，電導(dǎo)率急劇上升，體系變得很不穩(wěn)定，甚至出現(xiàn)分相現(xiàn)象［8］。

圖1 反膠束體系電導(dǎo)率與含水量的關(guān)系Fig.1 Relationship between electric conductivity and water content

由圖2可知，隨著AOT濃度的增加，反膠束體系中“微水池”數(shù)量增加，使體系的增溶水量顯著增加。但如果AOT濃度大于2mol/L，即使增溶少量的水，體系的黏度也會(huì)大幅增加，并有大量懸浮液滴產(chǎn)生，同時(shí)，反膠束微粒間可能會(huì)產(chǎn)生強(qiáng)烈的相互作用，導(dǎo)致電導(dǎo)率極不穩(wěn)定［8，11］。因此，本研究中AOT濃度范圍應(yīng)小于2mol/L，這與溫寶妹［12］研究結(jié)果AOT臨界膠束濃度為 2.014×10-3～2.975×10-3mol/mL相一致。

圖2 AOT濃度與反膠束臨界增溶水量的關(guān)系Fig.2 Relationship between AOT concentration and critical dissolved water

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)

2.2.1 AOT濃度對(duì)RKBP前萃率的影響 由圖3可知，RKBP前萃率隨AOT濃度增加而顯著提高，這是因?yàn)楫?dāng)AOT濃度增加時(shí)，會(huì)形成一些含有大量水分子的更大的反膠束，這些反膠束與小的反膠束相比，在增溶蛋白質(zhì)時(shí)，排除了由于蛋白質(zhì)體積大而不能增溶的限制。但是，當(dāng)AOT濃度增加到一定程度時(shí)，蛋白前萃率逐漸穩(wěn)定甚至有下降趨勢(shì)，這一現(xiàn)象可能是由于加入過(guò)量的AOT，導(dǎo)致反膠束體系的黏度增加，體系形成復(fù)雜的聚集體，對(duì)蛋白質(zhì)的增溶產(chǎn)生妨礙作用，增加萃取難度［11，13］。因此，本實(shí)驗(yàn) AOT 濃度初步確定為1.25mol/L。

圖3 AOT濃度對(duì)前萃率的影響Fig.3 Effect of AOT concentration on forward extraction yield

2.2.2 緩沖溶液pH對(duì)RKBP前萃率的影響 緩沖溶液pH對(duì)前萃率的影響主要是通過(guò)改變蛋白質(zhì)分子表面的電荷分配。傳統(tǒng)理論認(rèn)為，蛋白進(jìn)入“微水池”是由于蛋白質(zhì)分子表面電荷與表面活性劑分子極性頭所帶電荷相反，由于相反電荷相互吸引使蛋白增溶。由圖4可知，在pH6.0～7.5范圍內(nèi)，隨著緩沖液pH的增加，蛋白前萃率逐漸增加，這與傳統(tǒng)反膠束萃取理論相矛盾，該pH范圍內(nèi)蛋白質(zhì)增溶可能是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)分子和表面活性劑分子之間的疏水相互作用。當(dāng)pH大于7.5后，蛋白前萃率有下降趨勢(shì)，這是因?yàn)?，AOT為陰離子表面活性劑，當(dāng)緩沖液pH遠(yuǎn)大于紅蕓豆蛋白等電點(diǎn)(pI=4.5)時(shí)，蛋白質(zhì)分子和AOT均呈負(fù)電荷狀態(tài)，二者之間的靜電斥力導(dǎo)致反膠束體系對(duì)蛋白的增溶作用降低或消失［14］。因此，本實(shí)驗(yàn)初步確定緩沖液pH為7.5。

圖4 緩沖液pH對(duì)前萃率的影響Fig.4 Effect of pH on forward extraction yield

2.2.3 KCl濃度對(duì)RKBP前萃率的影響 由圖5可知，當(dāng)KCl濃度從0增加到0.05mol/L時(shí)，前萃率逐漸增加，而隨著KCl濃度的繼續(xù)增加，前萃率反而下降。這是因?yàn)?，一方面，鹽濃度增大，離子強(qiáng)度越大，反膠束內(nèi)表面雙電層變薄，減弱了蛋白質(zhì)與反膠束內(nèi)表面之間的吸引作用，降低了蛋白質(zhì)的溶解;另一方面，離子強(qiáng)度的增大也減弱了AOT極性基團(tuán)之間的靜電排斥作用，從而使極性基團(tuán)易于相互接近而形成較小的反膠束，導(dǎo)致臨界增溶水量減小，蛋白質(zhì)溶解能力減弱［10］。另外，當(dāng)離子濃度足夠大時(shí)還會(huì)發(fā)生鹽析現(xiàn)象或造成蛋白質(zhì)的變性［15］。因此，本實(shí)驗(yàn)初步確定KCl濃度為0.05mol/L。

2.2.4 萃取時(shí)間對(duì)蛋白前萃率的影響 反膠束體系的萃取過(guò)程一直處于不斷地碰撞結(jié)合、分散、再結(jié)合、再分散的動(dòng)態(tài)過(guò)程，促使“微水池”內(nèi)外不斷進(jìn)行物料交換。從圖6可以看出，隨著萃取時(shí)間的延長(zhǎng)，前萃率逐漸增加，但90min后前萃率逐漸趨于穩(wěn)定。這是因?yàn)椋环矫?，反?yīng)起始時(shí)速率高，蛋白質(zhì)能不斷增溶于“微水池”，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，“微水池”內(nèi)的蛋白濃度持續(xù)增加，蛋白質(zhì)進(jìn)入“微水池”的空間位阻相應(yīng)增加;另一方面，原料中蛋白含量逐漸減少，蛋白質(zhì)向原料表面遷移的速率也逐漸減小，這兩方面的共同作用導(dǎo)致傳質(zhì)過(guò)程逐漸減慢，使得萃取速率降低并趨于穩(wěn)定［16-17］。因此，本實(shí)驗(yàn)確定萃取時(shí)間為90min。

2.3 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素結(jié)果基礎(chǔ)上，以PKBP前萃率為指標(biāo)，選取對(duì)前萃率影響較顯著的AOT濃度、緩沖液pH和KCl濃度3個(gè)因素進(jìn)行L9(34)正交實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果和方差分析見(jiàn)表2和表3。

圖6 萃取時(shí)間對(duì)前萃率的影響Fig.6 Effect of time on forward extraction yield

由表2可以看出，3個(gè)因素對(duì)RKBP前萃率的影響大小順序?yàn)锳＞C＞B，即AOT濃度＞KCl濃度＞緩沖液pH，最優(yōu)組合為A2B2C2。結(jié)合表3方差分析可知，AOT濃度對(duì)前萃率的影響極顯著(p＜0.01)，其余兩因素對(duì)前萃率的影響顯著(p＜0.05)。因此，綜合考慮，反膠束提取RKBP的最佳前萃條件為A2B2C2，即AOT濃度為1.25mol/L、緩沖液pH為7.5，KCl濃度為0.05mol/L。由于優(yōu)化組合A2B2C2在上述9組實(shí)驗(yàn)中未出現(xiàn)，故對(duì)其進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。經(jīng)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)表明，A2B2C2組合的前萃率為43.57%，均優(yōu)于其他組合。

表2 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 Results and design test of orthogonal tests

表3 方差分析Table 3 Variance analysis for forward extraction yield

3 結(jié)論

研究表明，AOT/異辛烷反膠束體系的臨界增溶水量與AOT濃度呈正相關(guān)關(guān)系，不同AOT濃度對(duì)應(yīng)的臨界含水量值基本一致，即維持WC≈55不變。當(dāng)AOT濃度大于2mol/L時(shí)，即使增溶少量水，反膠束體系的黏度也會(huì)大幅增加，電導(dǎo)率也極不穩(wěn)定，因此本研究中AOT濃度上限為2mol/L。采用AOT-異辛烷-氯化鉀組成的反膠束體系萃取RKBP的最優(yōu)前萃條件為AOT濃度為1.25mol/L，緩沖液pH7.5，KCl濃度為0.05mol/L，萃取時(shí)間為90min，該條件下，前萃率可達(dá)43.57%。

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