Tricine-SDS-PAGE測定小麥蛋白酶解物分子量分布

張銳昌，王綺，張應(yīng)龍，徐志宏

（1.山東商業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，山東濟(jì)南 250103；2.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，廣東廣州 510640）

小麥蛋白（俗稱谷朊粉）是小麥淀粉生產(chǎn)的副產(chǎn)物，其蛋白質(zhì)含量高達(dá)72%～85%，主要由溶于70%（體積比）乙醇溶液的麥醇溶蛋白和溶于稀酸或稀堿溶液的麥谷蛋白組成。而且氨基酸組成比較齊全，是營養(yǎng)豐富，物美價廉的純天然植物性蛋白源。但是，由于小麥蛋白自身獨(dú)特的氨基酸組成，含有較多的疏水性氨基酸和不帶電荷的氨基酸，分子內(nèi)疏水作用區(qū)域較大，溶解度較低，往往不能滿足食品加工的需要，應(yīng)用具有很多局限性[1－2]。因此，考慮采用一定的改性手段，改善小麥蛋白的功能性，提高副產(chǎn)物綜合利用價值。而酶法改性已成為近年來小麥蛋白深加工研究領(lǐng)域中的一個熱點(diǎn)[3]。小麥蛋白經(jīng)特定的蛋白酶降解所形成的小分子肽類，不僅容易吸收，而且具有多種生理活性[4]。最近Matsui T[5]酶解小麥蛋白粉分離純化出抑制血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（ACE）活性最強(qiáng)的組分。張亞飛等[6]采用堿性蛋白酶水解小麥蛋白，得到的小麥肽經(jīng)小鼠體外脾淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)鑒定其具有免疫活性。程云輝等[7－9]利用小麥蛋白粉酶解制備的多肽具有抗氧化性。小麥蛋白酶解物可作為功能性食品、肽類藥物進(jìn)行開發(fā)，拓寬其應(yīng)用領(lǐng)域。但是目前對小麥蛋白酶解物功能性質(zhì)的研究較少，為了進(jìn)一步促進(jìn)小麥蛋白工業(yè)化開發(fā)轉(zhuǎn)化的需要，本文對小麥蛋白酶解物的功能性質(zhì)進(jìn)行了探討，以其為成果轉(zhuǎn)化中提供科學(xué)的佐證資料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要原料

小麥蛋白：產(chǎn)地江蘇徐州，蛋白質(zhì)≥75.0%；小麥蛋白酶解物：參考酶解工藝中華人民共和國農(nóng)業(yè)部功能食品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室自制[10－11]；魯花壓榨一級花生油：產(chǎn)地山東省萊陽市龍門東路39號。

1.1.2 試劑

丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、尿素：Sigma；四甲基乙二胺：（tetramethylethylenediamine，TEMED）；三羥甲基氨基甘氨酸：（Tricine，Sigma）；三羥甲基氨基甲烷：（Tris堿，Genview）；十二烷基硫酸鈉：（SDS，Sigma）；低分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn)品（Marker）：（Marker含有 Phosphprylase 97 kU、Albumin 66 kU、Glutamic dehydrogenase 53 kU、Glyceraldehyde－3－phosphatedehydrogenase 35 kU、Tryjpsinogen 24 kU）等5種成分可以直接使用，上樣量5 μL～10 μL）：北京鼎國生物技術(shù)發(fā)展中心有限責(zé)任公司；過硫酸銨（AP）：汕頭市光華化學(xué)廠；巰基乙醇、考馬斯亮藍(lán)R－250、冰醋酸、甲醇、甘油。

1.1.3 儀器

Min－protein垂直電泳槽、蛋白質(zhì)微量電泳儀：北京六一儀器廠；數(shù)碼照相。

1.2 方法

1.2.1 Tricine－SDS－PAGE 蛋白質(zhì)電泳緩沖液的配制[12－15]

正極緩沖液（10×）：將 121.14 gTris溶于400 mL重蒸水，用濃HCl調(diào)至pH為8.9，定容至500 mL；負(fù)極緩沖液（10×）：將 60.55 gTris、89.58 gTricine及 5.0 gSDS溶于400 mL重蒸水中，加水至終體積為500 mL；凝膠緩沖液（3×）：將 181.5 gTris、1.5 gSDS溶于 400 mL 重蒸水中，用濃HCl滴定至pH8.45，再加水稀釋至500 mL。樣品緩沖液由 4%SDS、12%甘油、50 mmol/L Tris、5%巰基乙醇（體積比），及少許溴酚藍(lán)（可以適當(dāng)調(diào)整溴酚藍(lán)的用量保證電泳時的最佳指示）組成，pH為6.8。

1.2.2 丙烯酰胺儲存液配制

3C丙烯酰胺儲存液：將48 g丙烯酰胺和1.5 g甲叉雙丙烯酰胺溶于重蒸水中至100 mL；

5C丙烯酰胺儲存液：用重蒸水溶解47 g丙烯酰胺和2.5 g甲叉雙丙烯酰胺成100 mL溶液。

1.2.3 電泳樣品與樣品緩沖液

將樣品與等體積的樣品緩沖液混合，蛋白質(zhì)樣品濃度為 2 mg/mL～5 mg/mL，上樣前沸水浴 5 min～10 min，每次點(diǎn)樣量 20 μL～30 μL[16]。

1.2.4 固定液、染色液和脫色液配制

固定液：50mL甲醇＋10mL冰醋酸，稀釋至100mL；染色液：考馬斯亮藍(lán)R250 1.25 g溶于230 mL甲醇中，再加40 mL冰醋酸，稀釋至500 mL；脫色液：50 mL甲醇＋75 mL冰醋酸，稀釋至1 000 mL。

1.2.5 電泳的操作方法

1.2.5.1 不同組成的丙烯酰胺溶液的配制

Tricine－SDS－PAGE的凝膠由不同分子組成的丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺混合液聚合而成。其中濃縮膠由3C丙烯酰胺儲存液配成4%的丙烯酰胺溶液聚合而成，夾層膠由3C丙烯酰胺儲存液配成10%的丙烯酰胺溶液聚合而成，致密膠由5C丙烯酰胺儲存液配成16.5%的丙烯酰胺溶液（添加36.5%尿素）聚合而成，凝膠配方見表1。

表1 丙烯酰胺溶液的組成Table 1 Composition of acrylamide solution

1.2.5.2 灌膠

凝膠制作采用三層不連續(xù)膠的結(jié)構(gòu)，由致密膠+夾層膠+濃縮膠構(gòu)成。灌膠前，各種丙烯酰胺溶液分別加入10 μL新鮮配制的10%的過硫酸氨和1 μL的100%的TEMED，隨即灌膠。注意慢速攪動，盡量避免空氣帶入膠中。灌膠順序?yàn)椋合裙嘞聦拥闹旅苣z，再覆蓋以中間的夾層膠，然后鋪濃縮膠。灌膠后立即加入幾滴飽和正丁醇溶液壓平界面，然后用濾紙吸取頂層的飽和正丁醇，再灌注下一層膠[17]。注入濃縮膠后嵌入梳子，靜置以聚合形成三明治式的不連續(xù)梯度凝膠。

1.2.5.3 點(diǎn)樣

用微量進(jìn)樣器汲取樣品，將探針深入凝膠孔距底部1/3處，小心注入樣品，輕輕抽出探針，防止樣品翻出凝膠孔，從而干擾試驗(yàn)結(jié)果。按標(biāo)號依次點(diǎn)樣，并及時記錄加樣順序和序號。

1.2.5.4 電泳

內(nèi)槽加入負(fù)極電泳緩沖液，外槽加入正極電泳緩沖液，形成Trcine－SDS－PAGE電泳系統(tǒng)。先用30 mA恒流電泳，當(dāng)樣品進(jìn)入分離膠后可以適當(dāng)?shù)奶岣叩?5 mA～40 mA。當(dāng)溴酚藍(lán)指示劑離膠片底部約有1 cm時停止電泳。注意剝膠時的技巧，先撬開其中一個的底角，然后用探針劃開底板兩側(cè)的膠壁，要努力保持膠片的完整。

1.2.5.5 膠片的處理

先將膠片放入中固定液中至少固定30 min。再放入染色液中染色1.5 h～2.0 h，再轉(zhuǎn)至脫色液中擴(kuò)散脫色，直到背景清晰。用甘油溶液孵育后用手動數(shù)碼照相機(jī)牌照。

2 結(jié)果與分析

2.1 胃蛋白酶酶解物多肽分子量大小的分布

由電泳中蛋白Marker標(biāo)準(zhǔn)回歸曲線圖1，得到方程 Y=－2.226 3X+5.341 9（R2=0.990 7）。

圖2 小麥蛋白胃蛋白酶酶解物多肽分子量的分布Table 2 Result of electrophoresis of pepsin hydrolysis

由圖2和表2可知，小麥蛋白胃蛋白酶酶解物的分子量主要集中在3.83 kU～7.47 kU，條帶分布清晰連續(xù)；隨著時間的延長，在8.68 kU附近有淡色的條帶出現(xiàn)；其次是在21.16、34.3 kU附近，隨著酶解程度的提高，出現(xiàn)了比較清晰的條帶，應(yīng)該屬于蛋白質(zhì)酶解物中分子量比較大的部分；不同酶解時間可以看出：隨著時間的延長，大分子量部分的條帶逐漸清晰，表明酶解反應(yīng)的程度不斷加強(qiáng)。同時，與小麥蛋白底物作了一個對照，小麥蛋白的電泳分布是從小分子量到大分子量的一條連續(xù)的條帶，而且主要集中到24 kU～96 kU大分子量中。

2.2 堿性蛋白酶酶解物多肽分子量大小的分布

由電泳中蛋白Marker標(biāo)準(zhǔn)回歸曲線圖3，得到方程 Y= －1.982 7X+5.234 4（R2=0.990 2）。

表3 小麥蛋白堿性蛋白酶酶解物多肽分子量的分布Table 3 Result of electrophoresis of Alcalase hydrolysis

由表3和圖4可知，在單純的堿性條件沒有加入蛋白酶的情況下電泳發(fā)現(xiàn)，堿性變性促使一部分蛋白質(zhì)發(fā)生降解，產(chǎn)生一些小分子量的物質(zhì)，在6.52 kU～10.14 kU，條帶清淡但分別連續(xù)；堿性水解產(chǎn)物在12.44 kU～14.26 kU有一部分，條帶比較清晰顯現(xiàn)；其水解成分主要集中在22.98 kU～27.25 kU附近，屬于中分子量的物質(zhì)；在33.43 kU～38.31 kU附近，有高分子量的多肽類物質(zhì)產(chǎn)生；最條帶的最頂端，有89.8 kU的大分子量的蛋白質(zhì)的條帶。與其相對照，小麥蛋白的分布比較連續(xù)，小分子量的條帶不明顯，主要集中分別在24 kU～96 kU之間。

小麥蛋白堿性蛋白酶酶解物電泳后的條帶主要集中在4.63 kU～8.56 kU，隨著酶解時間的延長，條帶逐漸的加寬同時變的更加清晰；其他高分子量酶解物分布條帶顏色較淡，比較模糊，可以肯定是呈連續(xù)分布的；在頂端可以看到32.3、45.4 kU兩條較淡的條帶，應(yīng)該屬于大分子量的物質(zhì)。

3 討論與結(jié)果

3.1 Tricine－SDS－PAGE 電泳方法的改良

利用SDS－PAGP電泳測定低分子蛋白多肽物質(zhì)的分子量，必須要控制凝膠孔徑的大小，Schagger等[18]使用濃縮膠，增加緩沖液的摩爾濃度，并且用Tricine代替甘氨酸作為終止離子，這樣便可在1 kU～100 kU得到線性關(guān)系，Swank等增加甲叉雙丙烯酞胺的濃度以及在SDS的凝膠中加8 mol/L尿素，能使測定的分子量值接近于預(yù)期值；石繼紅等[16]在凝膠中加入6mol/L尿素，分子量在2.512 kU～16.949 kU之間的小肽，其分子量對數(shù)和遷移率旱良好的線性關(guān)系。

本試驗(yàn)在用Tricine代替甘氨酸作為尾隨離子，增加濃縮膠中小肽的濃縮效果，并在分離膠中加36.5%尿素，降低聚丙烯酰胺凝膠孔徑的大小，取得了較好的效果，在3張膠片中，標(biāo)準(zhǔn)蛋自質(zhì)分子量的對數(shù)和其遷移距離都呈良好的線性關(guān)系（r＞0.99），并計算出3張膠片中原料蛋自質(zhì)和酶解產(chǎn)物中相同的小肽的分子量，大小的誤差都在允許范圍之內(nèi)。Tricine－SDSPAGE系統(tǒng)是分離小分子肽的簡便有效的方法，其中，分離膠中丙烯酰胺和雙丙烯酰胺的比例和濃度是影響分離效果的重要因素。而尿素能明顯改善對小分子肽的分離效果。另外，尿素膠的聚合速度也是一個重要因素，在制膠時，宜采用低濃度新鮮配置的AP和TEMED，使凝膠慢速聚合，才能獲得好的分離效果。此外，快速的固定、染色和脫色對于小分子多肽電泳是必要的。這主要是因?yàn)樾》肿佣嚯膶θ玖系慕Y(jié)合力較弱，長時間的染色和脫色容易擴(kuò)散沖洗掉而著色較差。隨著生物活性多肽物質(zhì)的發(fā)現(xiàn)和多肽類藥物的研制，小分子多肽電泳變得越來越重要，己成為生物活性物質(zhì)純化分析過程中不可缺少、經(jīng)常使用的快速鑒定方法。

3.2 Tricine－SDS－PAGE 電泳研究結(jié)果

1）小麥蛋白胃蛋白酶酶解物的分子量主要集中在3.83 kU～7.47 kU；條帶分布清晰連續(xù)；隨著時間的延長，在8.68 kU附近有淡色的條帶出現(xiàn)；其次是在21.16 kU、34.3 kU附近，隨著酶解程度的提高，出現(xiàn)了比較清晰的條帶，應(yīng)該屬于蛋白質(zhì)酶解物中分子量比較大的部分。

2）小麥蛋白堿性蛋白酶酶解物電泳后的條帶主要集中在4.63 kU～8.56 kU，隨著酶解時間的延長，條帶逐漸的加寬；堿性水解產(chǎn)物在12.44 kU～14.26 kU有一部分，條帶比較清晰顯現(xiàn)；其水解成分主要集中在22.98 kU～27.25 kU附近，屬于中分子量的物質(zhì)；在33.43 kU～38.31 kU附近，有高分子量的多肽類物質(zhì)產(chǎn)生；最條帶的最頂端，有89.8 kU的大分子量的蛋白質(zhì)的條帶。

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