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    不同誘變方法對(duì)透明質(zhì)酸產(chǎn)生菌株Sz560的誘變效應(yīng)

    2012-09-05 14:21:16丁勇石孝勇張新明
    食品研究與開(kāi)發(fā) 2012年12期
    關(guān)鍵詞:亞硝基致死率溶血性

    丁勇,石孝勇,張新明

    (陜西科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院,西安陜西 710021)

    透明質(zhì)酸(Hyaluronic Acid,簡(jiǎn)稱(chēng)HA)是一種高分子量的線性大分子粘多糖。1934年Meyer和Palmer首先從牛眼玻璃體中分離出透明質(zhì)酸[1],它是由β-D-葡萄糖醛酸(G1cUA)和β-D-N-乙酰氨基葡萄糖(G1cNAc)所構(gòu)成的雙糖單位重復(fù)交替連接而成的連鎖狀高分子物質(zhì)[2]。透明質(zhì)酸具有特殊的生理作用、流變學(xué)特性和極強(qiáng)的持水保濕能力,廣泛應(yīng)用于醫(yī)療、食品、化妝品工業(yè)等領(lǐng)域。

    透明質(zhì)酸生產(chǎn)主要有動(dòng)物組織提取法和微生物發(fā)酵法。動(dòng)物組織原料來(lái)源有限,且透明質(zhì)酸的含量少、組織成分復(fù)雜、提取分離困難。而微生物發(fā)酵法所需原料簡(jiǎn)單、產(chǎn)量不受原料的限制、能夠生產(chǎn)更高的分子量的透明質(zhì)酸、由于與菌體分離、提取過(guò)程簡(jiǎn)單,因此發(fā)酵法成為透明質(zhì)酸生產(chǎn)的發(fā)展方向。目前微生物發(fā)酵法生產(chǎn)透明質(zhì)酸的工業(yè)菌株多來(lái)源于鏈球菌屬[3-4],經(jīng)過(guò)傳統(tǒng)的物理和化學(xué)誘變方法篩選高產(chǎn)菌株,而誘變方法選擇是否得當(dāng)直接關(guān)系到突變株的性狀表達(dá)。本文利用紫外線、硫酸二乙酯、亞硝基胍處理原始菌株Sz560以期獲得無(wú)溶血性、高效生產(chǎn)透明質(zhì)酸的突變體。

    1 材料和方法

    1.1 菌種

    本實(shí)驗(yàn)的菌種來(lái)源于陜西科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院保藏的馬腺疫鏈球菌獸疫亞型,實(shí)驗(yàn)室保藏號(hào)Sz560。

    1.2 培養(yǎng)基

    血瓊脂平板:70 mm血平板,購(gòu)自華美生物有限公司。

    種子培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖 20,NaCl 5,蛋白胨 15,酵母膏 10,牛肉膏 10,KH2PO40.5,MgSO4·7H2O 0.2,K2HPO41.5,滅菌前調(diào)整pH7.0,121℃滅菌20 min,冷卻至溫度低于50℃,無(wú)菌條件下加人1%優(yōu)級(jí)小牛血清。

    搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖 20,NaCl 5,蛋白胨15,酵母膏 10,牛肉膏 10,KH2PO40.5,MgSO4·7H2O 0.2,滅菌前調(diào)整pH7.0,121℃滅菌20 min。

    1.3 儀器與設(shè)備

    Eppendorf centrifuge 5810R(Eppendorf)、J2-Mc 高速冷凍離心機(jī):美國(guó)Beckman公司;SW-CJ-1F超凈工作臺(tái):蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)公司;pHs-ZC型pH計(jì):上??茖W(xué)儀器廠。

    1.4 致死率

    以致死率確定誘變劑量,將誘變后的菌懸液與未經(jīng)誘變的菌懸液經(jīng)適當(dāng)稀釋分別涂布于種子培養(yǎng)基平板上,前者平板上的菌落數(shù)為A,后者平板上的菌落數(shù)為B。計(jì)算致死率:

    1.5 透明質(zhì)酸分析

    Bitter-Muir法[5-6]

    1.6 透明質(zhì)酸分析

    烏式黏度計(jì)法

    1.7 菌種的誘變方法

    1.7.1 紫外線誘變處理

    15 W紫外誘變過(guò)程:紫外燈功率15 W,照射距離39 cm,照射前打開(kāi)紫外燈預(yù)熱20 min,將裝有菌懸液平皿置于磁力攪拌器上,照射 20、30、40、50、60 s,稀釋104~105倍涂布于血平板上,37 ℃避光培養(yǎng) 18 h~32 h。

    1.7.2 硫酸二乙酯誘變

    取4.5 mL菌懸液加入10%的硫酸二乙酯溶液0.5 mL,混勻放入37℃水浴鍋,50 r/min振蕩水浴10、20、30、40 min;在 4 ℃,6 000 r/min 條件下離心 10 min,去上清;加入1 mL,2.5%硫代硫酸鈉溶液充分混勻,終止誘變反應(yīng),離心去上清;取1 mL生理鹽水懸浮,稀釋倍數(shù)104~105涂血平板。

    1.7.3 亞硝基胍誘變

    取1 mL種子培養(yǎng)液,4℃,6 000 r/min離心10 min,去上清;取1 mL濃度為0.1 g/L的亞硝基胍溶液懸浮,立即放入水浴鍋中,50 r/min振蕩水浴10、20、30 min;在4℃,6 000 r/min條件下離心10 min,去上清,加入1 mL,0.1 mol/L,pH6.0的磷酸鹽緩沖液,終止誘變反應(yīng),立即4℃,6 000 r/min離心10 min,去上清,重復(fù)3次;取1 mL生理鹽水懸浮,經(jīng)37.5℃培養(yǎng)30 min;稀釋 103~104倍涂血平板。

    2 結(jié)果與討論

    2.1 紫外照射的誘變效應(yīng)

    表1為紫外照射時(shí)間對(duì)致死率的影響,Sz560對(duì)紫外照射的耐受性差,照射時(shí)間延長(zhǎng),致死率越高,篩選到透明質(zhì)酸產(chǎn)量提高幅度較大的突變株的幾率增加,傳代培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)在致死率高的條件下回復(fù)突變率相應(yīng)增加,照射時(shí)間大于80 s,致死率超過(guò)99.9%。表2為篩選出透明質(zhì)酸產(chǎn)量有一定提高的突變株菌落形態(tài)特征,主要分為三大類(lèi),A類(lèi)菌落直徑小于原始菌株(菌落直徑2 mm~4 mm,菌落呈乳白色、灰白色、半透明、血平板培養(yǎng)菌落表面較濕潤(rùn)),其它形態(tài)特征與性狀接近于原始菌株,B類(lèi)菌落基本接近原始菌株,C類(lèi)在普通平板培養(yǎng)下,菌落表面有少量褶皺,血平板培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)透明圈直徑減少,清晰度略有下降。

    表1 紫外照射時(shí)間與致死率的關(guān)系Table 1 Relationship between UV treatment time and the mortality

    表2 紫外誘變突變株的菌落形態(tài)特征Table 2 Colony morphology of UV mutant

    2.2 硫酸二乙酯的誘變效應(yīng)

    表3為硫酸二乙酯水浴處理時(shí)間對(duì)致死率的影響,前10 min致死率達(dá)到63.05%,隨水浴時(shí)間延長(zhǎng)致死率非線性同步上升,增加幅度趨緩。表4為篩選出透明質(zhì)酸產(chǎn)量大幅提高的突變株菌落形態(tài)特征,該類(lèi)菌落直徑僅為原始菌株的30%~50%,菌落呈圓形、表面光滑、挑起有拉絲感、無(wú)溶血性透明圈,見(jiàn)圖1。

    2.3 亞硝基胍的誘變效應(yīng)

    表5為亞硝基胍水浴處理時(shí)間對(duì)致死率的影響,前10 min致死率達(dá)到69.08%,隨水浴時(shí)間延長(zhǎng)致死率非線性同步上升,增加幅度趨緩。表6為篩選出透明質(zhì)酸產(chǎn)量大幅提高的突變株菌落形態(tài)特征,菌落直徑、形態(tài)差異性較大,菌落呈圓形、表面光滑、挑起有拉絲感、無(wú)溶血性透明圈。

    表3 DES處理時(shí)間與致死率的關(guān)系Table 3 Relationship between DES treatment time and the mortality

    表4 硫酸二乙酯誘變突變株的菌落形態(tài)特征Table 4 Colony morphology of DES mutant

    表5 亞硝基胍處理時(shí)間與致死率的關(guān)系Table 5 Relationship between NTG treatment time and the mortality

    2.4 透明質(zhì)酸生產(chǎn)菌復(fù)篩

    3種誘變方法得到的生產(chǎn)性狀最好的突變菌株與原始菌株對(duì)比,由表7可知,NTG誘變得到的突變株透明質(zhì)酸產(chǎn)量和相對(duì)分子量提高幅度大,因而確定NTG為高產(chǎn)透明質(zhì)酸生產(chǎn)菌的右邊手段。

    表6 亞硝基胍誘變突變株的菌落形態(tài)特征Table 6 Colony morphology of NTG mutant

    表7 突變株復(fù)篩結(jié)果Table 7 Result of mutant re-screening

    2.5 遺傳穩(wěn)定性試驗(yàn)

    紫外誘變、硫酸二乙酯誘變、亞硝基胍誘變得到的各一支產(chǎn)量表達(dá)提高的突變菌株進(jìn)行了傳代試驗(yàn),結(jié)果如圖3所示。亞硝基胍誘變的突變株產(chǎn)量高、遺傳穩(wěn)定性好,五代培養(yǎng)后產(chǎn)量下降幅度小于10%,生物量下降幅度小于15%。亞硝基胍誘變得到的突變株所做的遺傳穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn),由圖4可知,隨著傳代次數(shù)的增加,透明質(zhì)酸分子量與產(chǎn)量下降,在第六代透明質(zhì)酸的產(chǎn)量與分子量下降幅度大,因此生產(chǎn)條件下五代以后要重新活化培養(yǎng)。

    2.5 誘變方法對(duì)比

    誘變菌株均采用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,代謝旺盛,生物活性高,易變異[7]。紫外線誘變使DNA分子形成嘧啶二聚體使雙鏈結(jié)構(gòu)扭曲變形,阻礙堿基間的正常配對(duì)、引起堿基轉(zhuǎn)換、顛換、移碼突變或缺失產(chǎn)生突變株,紫外誘變致死效果明顯,突變體類(lèi)型較多,正突變率遠(yuǎn)小于負(fù)突變率,回復(fù)突變率也很高,遺傳性狀不穩(wěn)定,單一使用效果差。硫酸二乙酯和亞硝基胍屬于烷基化試劑,使堿基許多位置上增加了烷基引起DNA分子錯(cuò)配從而獲得突變株,硫酸二乙酯主要引起點(diǎn)突變,而亞硝基胍可作用于復(fù)制叉附近,引起多重突變株出現(xiàn),因此出現(xiàn)菌落形態(tài)特征明顯不同的突變株。

    3 結(jié)論

    誘變育種是工業(yè)微生物育種的重要手段,本次試驗(yàn)考察了紫外誘變、硫酸二乙酯、亞硝基胍3種誘變劑對(duì)透明質(zhì)酸產(chǎn)生菌馬腺疫鏈球菌獸疫亞型(Streptococcus zooepidemicus)Sz560進(jìn)行誘變處理,通過(guò)傳代、發(fā)酵等試驗(yàn)驗(yàn)證誘變效果,對(duì)比得出:

    1)3種誘變方法對(duì)透明質(zhì)酸產(chǎn)生菌顯示出較大的差異,從溶血性角度看硫酸二乙酯降低溶血性效果好,經(jīng)過(guò)3輪誘變篩選到無(wú)溶血性菌株,亞硝基胍經(jīng)過(guò)6~10輪誘變篩選到無(wú)溶血性菌株,紫外誘變沒(méi)有篩選到無(wú)溶血性菌株;從透明質(zhì)酸產(chǎn)量及分子量增幅角度看依次為:亞硝基胍>硫酸二乙酯>紫外誘變。其中,采用亞硝基胍誘變得到一支突變株,搖瓶培養(yǎng)的條件下透明質(zhì)酸產(chǎn)量達(dá)到0.498 mg/mL,分子量1.12×106u。

    2)對(duì)照血平板和普通平板的菌落形態(tài),高產(chǎn)菌株的菌落表面濕潤(rùn)、光滑,接種針挑起有明顯的拉絲狀態(tài),菌落的黏性大,這直接可提供比對(duì)參考,作為平板分離初篩高產(chǎn)透明質(zhì)酸突變體的依據(jù),從而避免較為復(fù)雜、耗時(shí)的透明質(zhì)酸的化學(xué)分析檢測(cè),降低篩選的工作強(qiáng)度。誘變過(guò)程出現(xiàn)菌落直徑縮小、凸起更明顯、菌落褶皺平鋪形態(tài)的多種突變體,這種突變體與溶血性及產(chǎn)量沒(méi)有趨勢(shì)性關(guān)系。

    [1]Meyer K,Palmer J W.The Polysaccharide of the vitreous humor[J].BioChem,1934,10(7):629-634

    [2]LaurentTC.BiochemistryofHyaluronan[J].ActaOtolaryngol(Stockh),1987,44(2):7-12

    [3]郭學(xué)平,凌沛平,王春喜,等.透明質(zhì)酸的生產(chǎn)[J].藥物生物技術(shù),2000,7(1):61-63

    [4]Barrie F C,Lars M B,Richard M.Microbialhyaluronic acid production[J].ApplMicro Biot,2004,66(4):341-351

    [5]凌沛學(xué).透明質(zhì)酸[M].北京:中國(guó)輕工業(yè)出版社,2000:41-42

    [6]Bitter T,Muri H M.A modified uronic acid carbazole reaction[J].Anal Biochem,1962,4(6):330-334

    [7]丁東紅,徐文靜,等.利用玉米漿發(fā)酵生產(chǎn)類(lèi)胡蘿卜素紅酵母的誘變選育,2010,21(9):159-162

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