茶葉多糖的純化工藝

王黎明，夏文水

（1.無錫商業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇無錫 214153；2.江南大學(xué)，江蘇無錫 214036）

近年，茶多糖因具有較多的生理保健功能，引起了很多研究者的興趣，特別是從粗老茶中提取茶多糖，既可以開發(fā)保健食品，也可以綜合利用資源，成本低、價值高。但是茶多糖的提取純化過程中，初步純化工藝是個較難處理的工藝過程。如果方法選擇得當(dāng)，純化效果好，速度快，成本低；反之，則效果差，速度慢，成本高。雖然純步純化工藝已有許多報道，但多數(shù)是就某個方面的純化工藝。倪德江等報道，Sevag法脫蛋白的效果主要在前三次，不同茶類，蛋白質(zhì)的去除率不同[1]。陳海霞等則用聚酰胺吸附法脫除茶多糖中水溶性色素[2]。也有很多報道用氧化法，即用H2O2作氧化劑將色素氧化成無色物質(zhì)。黃桂寬等用40%和60%的乙醇分級沉淀茶多糖，干燥后分別得淺黃色和灰白色兩種多糖TP－1和TP－2，得率分別為2.8%和0.7%，總糖含量分別為48.24%和57.71%，其中TP－1為中性雜多糖[3]。楊其林用CTAB沉淀茶多糖，得率為1.34%[4]。陳海霞等分別用醇沉淀法、超濾法和CTAB沉淀法制備了茶多糖粗提物[5]。汪東風(fēng)等將粗多糖過Sephadex G200柱，0.1 mol/L NaCl溶液洗脫，得茶多糖純化物[6]。王丁剛等也將茶多糖粗品過 Sephadex G200，用0.1 mol/L NaCl溶液洗脫，得到純化的茶多糖[7]。嚴(yán)明潮等研究發(fā)現(xiàn)超濾膜的材料會直接影響茶多糖的含量和得率，研究認(rèn)為選擇在50℃下浸提45 min，選用截留相對分子質(zhì)量為8萬～10萬的聚砜膜在50℃、0.2 MPa下分離是比較理想的[8]。

本文將對茶多糖的初步純化工藝作較為詳細(xì)、系統(tǒng)的研究，側(cè)重于實用和低成本。

1 材料與方法

1.1 材料

五級綠茶由無錫翠竹茶葉有限公司饋贈，所有試劑均為國產(chǎn)試劑。

1.2 方法

1.2.1 原料預(yù)處理及茶多糖提取方法

[8]。

1.2.2 粗多糖相對分子質(zhì)量分布的測定

高效凝膠過濾色譜法，色譜柱：UltrahydrogelTMLinear 300 mm×7.8 mmid×2；流動相：0.1M NaNO3；流速：0.9 mL/min；柱溫：45 ℃；多糖標(biāo)樣：Dextran T－2000，Dextran T－500，Dextran T－70，Dextran T－40，Dextran T－10，Dextran T－5；分子量線性方程：Log Mol Wt=13.0－0.461T（r=0.997）。

1.2.3 Sevag法脫蛋白

茶多糖溶液中加入1/3體積的Sevag試劑（氯仿：正丁醇=4∶1），室溫下磁力攪拌 30 min，靜置 2 h，分離除去白色乳濁液。取少許多糖溶液，并稀釋至合適的濃度，苯酚－硫酸法測定多糖和考馬斯亮蘭法[9]測定蛋白質(zhì)含量。

1.2.4 樹脂和聚酰胺的預(yù)處理

大孔吸附樹脂在乙醇中充分浸泡后，用乙醇洗至洗出液加適量水無白色渾濁，再用去離子水洗凈乙醇，加5%HCl溶液浸泡3 h，去離子水洗至中性，加5%NaOH浸泡3 h，去離子水洗至中性，備用。聚酰胺用水充分溶脹后，依次用5%HCl和5%NaOH洗滌，方法同上。

1.2.5 脫色材料的篩選

取預(yù)處理過的聚酰胺和大孔吸附樹脂各10 mL，加入20 mg/mL茶多糖溶液20 mL，攪拌過夜，充分靜置，過濾，380 nm測定吸光度[10]，計算脫色率。并測定多糖和蛋白質(zhì)含量，計算多糖保留率和蛋白去除率。

1.2.6 聚酰胺動態(tài)脫色

取預(yù)處理過的聚酰胺，裝柱（2.6 cm×80 cm），使用前用50%甲醇水溶液洗滌2個柱體積，再用去離子水平衡。茶多糖配制成20 mg/mL溶液，上柱，去離子水洗脫（28 mL/h）1個柱體積后改用0～70%乙醇梯度洗脫。380 nm測定洗脫液吸光值，計算脫色率。苯酚－硫酸法檢測多糖，計算多糖保留率。

1.2.7 Sephadex G50脫色

樣品上Sephadex G50（1.6×100 cm）。上樣量：柱體積的 5%；洗脫液：0.1 M NaCl，流速：12 mL/h，380 nm檢測洗脫液吸光值，硫酸－苯酚法檢測多糖，收集多糖組分。

1.2.8 脫色率

1.2.9 多糖純化倍數(shù)

1.2.10 多糖保留率

1.2.11 蛋白去除率

2 結(jié)果與分析

2.1 粗多糖的得率及其分子量分布

茶多糖提取液中加入乙醇濃度為94%的工業(yè)酒精至乙醇濃度為70%，室溫過夜，離心，沉淀進(jìn)行冷凍干燥，得率為3.2%，高于資料報道的2.97%的最高提取率，純度為47%。測定粗多糖的分子量分布，其主峰的相對分子質(zhì)量為11 291，峰3的相對分子質(zhì)量為451，說明茶多糖提取液中小分子雜質(zhì)較多（圖1）。

2.2 粗多糖脫游離蛋白

常用的脫蛋白方法有Sevag法[11－12]、三氟三氯乙烷法[13]、三氯乙酸法[14－15]。茶多糖提取液中加入不同量的三氯乙酸（4℃環(huán)璄中），發(fā)現(xiàn)茶多糖溶液的顏色由淡黃色變?yōu)榧t褐色，沒有白色沉淀形成。加入乙醇至70%濃度，靜置過夜，也沒有形成絮狀沉淀，用截留分子量為5000的透析袋透析48 h，檢測袋內(nèi)溶液，發(fā)現(xiàn)袋內(nèi)多糖含量極低，表明茶多糖被三氯乙酸降解，因此不宜用三氯乙酸脫除茶多糖中的雜蛋白，因而改用Sevag法，效果如圖2。

從圖2可以看出，用Sevag法除茶多糖中的游離蛋白，第1次效果最好，蛋白脫除量大，多糖損失小；3次以后，蛋白含量的變化很小，而多糖損失卻很嚴(yán)重，因此用Sevag法除茶多糖蛋白，重復(fù)3次即可。重復(fù)3次，茶多糖的總蛋白去除率約為28%，由原來的15%下降到了11%。

2.3 茶多糖脫色

2.3.1 脫色材料的篩選

茶色素是黃酮類和多酚類的氧化聚合物的異質(zhì)類群，由茶紅素和茶褐素組成。茶紅素是主體，占茶色素總量的85%以上，以兒茶素二聚物和低聚物為主，茶褐素以兒茶素高聚物為主，占茶色素的10%～15%[16]。一般小分子量的茶紅素易溶于水，而大分子量的茶褐素易溶于醇。

乙醇沉淀多糖，可除去部分水溶性色素，但仍有大量醇溶性色素不能去除，需采用其它方法去除。常用的脫色方法中，金屬絡(luò)合法具有很強的選擇性，而氧化法是用H2O2將茶色素氧化為無色物質(zhì)，未真正去除色素物質(zhì)，因此這兩種方法均不宜采用。由于茶色素的酚羥基和多糖的醇羥基均可與堿性陰離子交換樹脂發(fā)生離子交換作用而形成牢固的作用力，需用高濃度的鹽和堿才能洗脫，而茶多糖在堿性條件下不穩(wěn)定，因此需選用作用力較弱的吸附作用或氫鍵作用進(jìn)行脫色。常用于脫色的作用力較弱的吸附劑有活性碳、硅藻土和吸附樹脂等，而聚酰胺常用于多酚類和黃酮類的分離[17]?；钚蕴己凸柙逋镣ㄟ^表面作用將介質(zhì)中直徑小于其孔徑的雜質(zhì)吸附到孔隙中，而茶色素的相對分子質(zhì)量分布較廣，因此該方法也不能完全去除茶多糖中色素。

大孔吸附樹脂和聚酰胺既具有表面吸附作用，又有氫鍵作用，是近代發(fā)展起來的一類有機高聚物吸附劑，其中 DM130、S8、HPD500、HZ801、AB8 、NKA2 是對黃酮和多酚類化合物有較好分離效果的大孔吸附樹脂。表1表明以上材料脫色率由大到小依次為：聚酰胺＞DM130＞S8＞HPD500＞HZ801＞AB8＞NKA2；多糖的保留率依次為：S8＞DM130＞聚酰胺＞HPD500＞AB8＞NKA2＞HZ801。從表中還可以看到，聚酰胺和大孔吸附樹脂都有一定的脫蛋白效果，其中聚酰胺對蛋白的去除率最高，約為26%，各種大孔吸附樹脂對蛋白的去除率相近，均在20%左右。雖然S8對多糖的保留率比聚酰胺高，但蛋白去除率和脫色率都不如聚酰胺高，因此宜選用聚酰胺脫色。

表1 聚酰胺和大孔吸附樹脂靜態(tài)脫色效果Table 1 Decolor effects of polyamide and macropore adsorptive

2.3.2 聚酰胺柱動態(tài)脫色效果

聚酰胺分子中存在眾多酰胺鍵，可與酚類、酸類、醌類、黃酮類等多種化合物形成氫鍵而吸附，在水中形成氫鍵的能力強，吸附強，在有機溶劑中則較弱，在酸性溶劑中強，堿性溶劑中最弱。利用上述性質(zhì)可采用不同溶劑吸附，不同極性或pH的溶劑洗脫，即可達(dá)到脫色目的。由于茶多糖在堿性條件下不穩(wěn)定，所以宜用去離子水先將不吸附組分洗脫，再用有機溶劑將各組分按氫鍵作用力由弱到強的順序梯度洗脫。常用的有機溶劑為乙醇。

去離子水可將大部分多糖與色素分離，但仍有部分多糖與聚酰胺結(jié)合緊密，需用高濃度乙醇將其洗脫。收集多糖含量較高的洗脫峰（圖3），真空濃縮的同時去除乙醇，冷凍干燥，得TPS1和TPS2。TPS1約回收了總多糖的60.3%，其純度由Sevag法脫蛋白后的49.8%提高到了70.2%，超過大多數(shù)市售茶多糖產(chǎn)品60%左右的純度，純化倍數(shù)為1.49。顏色由原來的深紅色變?yōu)榈S色，TPS2約回收了總多糖的28%，仍含有大量色素。

實驗過程中還發(fā)現(xiàn)，將粗多糖配制成高濃度水溶液，室溫下放置3 d～4 d，產(chǎn)生了大量白色沉淀，測定結(jié)果表明該沉淀主要為蛋白質(zhì)。推測是因為多糖干燥時，蛋白質(zhì)和膠質(zhì)等雜質(zhì)發(fā)生了變性固化，當(dāng)用水再次溶解，變性的蛋白質(zhì)難以在水溶液中穩(wěn)定存在。用該法先除去部分蛋白，再上聚酰胺柱脫色的同時脫蛋白，取得了良好的脫蛋白效果。

2.3.3 TPS1進(jìn)一步脫色

李布青等將脫蛋白后的茶多糖用DEAE－纖維素柱分離，0.1 mol/L NaOH洗脫，獲得較純的茶多糖。許新德等也將粗老綠茶過DEAE－纖維素柱，得一中性多糖和3個酸性多糖[17]。但是本人在研究過程中也發(fā)現(xiàn)，用DEAE－纖維素柱分離脫蛋白后的茶多糖時，不僅大量色素被吸附在柱材料上，茶多糖也被大量吸附在柱材料上，用2.0 mol/L的NaCl溶液洗脫，仍不能將茶多糖大部分洗脫下來。洗脫下來的茶多糖脫鹽耗時也非常長。因此選用了Sephadex G50柱進(jìn)一步純化茶多糖。

Sephadex G50分離多糖的相對分子量范圍為500～10 000，而所提取的茶多糖相對分子質(zhì)量主要集中10 000左右，大部分能全排阻洗脫。圖4也表明茶多糖大部分多糖能全排阻洗脫，但仍有約10%的多糖難以與色素分離，推測這部分多糖可能與部分色素呈結(jié)合態(tài)。收集全排阻峰，用截留分子量為3 000的透析袋透析，冷凍干燥，得白色的TPS1－1。脫色率約為58%，蛋白去除率約為25%，多糖保留率約為88%，多糖的純度由70%提高到了89%，蛋白質(zhì)含量由6.1%下降到4.5%。

3 結(jié)論

采用Sevag法脫蛋白、聚酰胺柱脫色、以及Sephadex G50進(jìn)一步脫色的各步脫色率、純化倍數(shù)、純度、脫蛋白率和蛋白含量見表2。

從表2中可以看出，將含有蛋白和色素的粗多糖用Sevag法脫蛋白，3次可使蛋白含量由15%降低至11%，再經(jīng)聚酰胺柱動態(tài)脫色，多糖純度大幅度提高，經(jīng)Sephadex G50柱進(jìn)一步脫色后，即可得到純度較高的多糖。因此，茶多糖的初步純化工藝可采用：Sevag法脫蛋白→聚酰胺柱脫色→SephadexG50進(jìn)一步脫色。

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