胞外唾液酸酶造成工程中國倉鼠卵巢細胞株所產(chǎn)人源重組促紅素唾液酸含量降低

劉穎慰，周祥山，劉海峰,3，宋志偉，張元興

1 華東理工大學生物反應器工程國家重點實驗室，上海 2002372 新加坡科技研究局生物過程技術研究所，新加坡 1386683 山東阿華生物藥業(yè)有限公司，山東 東阿 252201

胞外唾液酸酶造成工程中國倉鼠卵巢細胞株所產(chǎn)人源重組促紅素唾液酸含量降低

劉穎慰1，周祥山1，劉海峰1,3，宋志偉2，張元興1

1 華東理工大學生物反應器工程國家重點實驗室，上海 200237
2 新加坡科技研究局生物過程技術研究所，新加坡 138668
3 山東阿華生物藥業(yè)有限公司，山東 東阿 252201

劉穎慰, 周祥山, 劉海峰, 等. 胞外唾液酸酶造成工程中國倉鼠卵巢細胞株所產(chǎn)人源重組促紅素唾液酸含量降低. 生物工程學報, 2012, 28(12): 1492?1499.

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為了對工程中國倉鼠卵巢 (CHO) 細胞所產(chǎn)人源重組促紅素 (rhEPO) 的N-糖基化特點進行考察，靜置培養(yǎng)工程細胞后，通過等電聚焦和凝集素共沉淀對培養(yǎng)上清中的 rhEPO進行分析，并對無血清培養(yǎng)上清中乳酸脫氫酶 (LDH) 和唾液酸酶活性進行檢測，發(fā)現(xiàn)這株CHO細胞可以表達唾液酸含量較高的rhEPO蛋白。但是隨著培養(yǎng)時間的延長，細胞的存活率逐漸降低，死亡的細胞將胞內(nèi)的唾液酸酶釋放到胞外，唾液酸酶的降解作用會造成N-糖鏈分枝末端的唾液酸占有率降低，導致rhEPO蛋白糖基化形態(tài)的變化。所使用的方法及得到的結果為進一步對工業(yè)過程進行分析提供了參考。

中國倉鼠卵巢細胞株，人源重組促紅素，N-糖基化，細胞活性，唾液酸酶

重組人促血紅細胞生成素 (Recombinant human erythropoietin, rhEPO) 被用來治療貧血，2009年在美國的銷售額是63億美元[1]。唾液酸可以保護 rhEPO不被生物體肝臟內(nèi)的無唾液酸糖蛋白受體清除，所以經(jīng)皮下注射，唾液酸化的rhEPO的體內(nèi)半衰期是 5.6 h，沒有唾液酸化的rhEPO在體內(nèi)的半衰期是1.4 min[2]。

山東阿華生物藥業(yè)有限公司在固定床灌注培養(yǎng)模式下培養(yǎng)CHO細胞株生產(chǎn)rhEPO，最高可以獲得20 000 IU/mL的表達量，但是在生產(chǎn)過程中，該細胞株表達的rhEPO蛋白中至少有70%是唾液酸含量不足的，會在后期的純化過程中被去除[3]。這會增加相同市場需要條件下的生產(chǎn)批次，增加成本，因此，通過優(yōu)化來提高高唾液酸豐度的rhEPO在細胞所生產(chǎn)蛋白中的比例，是一項十分緊迫的任務。

生產(chǎn)過程中，表達系統(tǒng)的修飾作用是糖基化形成的生物學基礎，不同的表達系統(tǒng)對同一產(chǎn)品的糖基化修飾存在差異[4-5]。因此我們首先對生產(chǎn)使用的CHO細胞株的N-糖基化特點進行考察。

在固定床反應器中，CHO細胞貼附在載片上，使用有血清培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞達到較高的密度后，清洗培養(yǎng)體系，直接更換為無血清培養(yǎng)條件來生產(chǎn)重組蛋白，細胞表達的rhEPO產(chǎn)品被分泌到胞外的培養(yǎng)上清中，整個生產(chǎn)過程中細胞無法被采樣，所以文中主要以培養(yǎng)該株CHO細胞所獲得的培養(yǎng)上清為研究對象。

很多方法被用來分析糖蛋白的唾液酸化程度[6]。Lim 等[7]使用等電聚焦結合轉(zhuǎn)膜印跡的方法對培養(yǎng)上清中的 rhEPO蛋白的唾液酸化程度進行檢測，這個方法不需要純化蛋白，對樣品進行脫鹽處理即可。文中使用肽 N-糖苷酶 F(PNGase F) 酶切除不同培養(yǎng)時期收獲的 rhEPO的N-糖鏈后進行等電聚焦，考察該株細胞所產(chǎn)的rhEPO的肽鏈結構、O-糖鏈形態(tài)等是否會隨培養(yǎng)時間的延長而發(fā)生改變。

蓖麻凝集素I (Ricinus communisagglutinin I,RCA-I) 是從蓖麻種子中分離得到的一種凝集素，這種凝集素可以特異性與寡糖鏈上的半乳糖或N-乙酰乳糖氨結合，但是當糖鏈末端的半乳糖與唾液酸結合，唾液酸會阻斷該種凝集素與半乳糖的結合。因此可以通過 RCA-I與蛋白共沉淀的方法定性檢測糖蛋白N-糖鏈末端的唾液酸占有率[8]。

當細胞活性降低，細胞膜嚴整性降低，胞內(nèi)的乳酸脫氫酶 (Lactate dehydrogenase, LDH) 會進入胞外環(huán)境中，文中通過檢測培養(yǎng)上清中的LDH活性來作為培養(yǎng)液中細胞的活性的指示[9]。同時，胞外的重組蛋白會被死亡細胞釋放的唾液酸酶 (Sialidase) 去唾液酸化[10]。RNAi研究[11-12]顯示，抑制CHO細胞唾液酸酶的表達可以在一定程度上提高蛋白產(chǎn)品的唾液酸含量。因此，文中對培養(yǎng)過程中胞外唾液酸酶活性的變化及其對CHO細胞所產(chǎn)rhEPO的唾液酸含量的影響進行考察。

通過上述的研究，我們嘗試對該株工程CHO細胞在培養(yǎng)過程中不同階段收獲的 rhEPO的糖基化特點及影響因素進行闡釋。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株及培養(yǎng)基

實驗使用生產(chǎn)rhEPO的工程CHO細胞株，由山東阿華生物藥業(yè)有限公司提供。DMEM 培養(yǎng)基、F12培養(yǎng)基、CHO-S-SFMⅡ培養(yǎng)基和新生牛血清 (NBCS) 均購自美國Gibco公司。

1.1.2 主要試劑

本實驗使用的常規(guī)化學試劑主要購自中國醫(yī)藥集團上?；瘜W試劑公司，均為分析純級。兩性電解質(zhì) (Pharmalyte pH 3.0～10)、樣品緩沖液(IPG buffer)、凝膠支持膜 (Gel Bond PAG film)均購自美國GE Healthcare公司；固相pH梯度介質(zhì) (pI select)、四甲基傘形酮標準品 (4MU) 購自美國Sigma公司；α-2,3唾液酸酶 (P0728S)、PNGase F酶 (P0704S) 購自美國 NEB公司；Ricinus communisagglutinin-I (RCA-I) 凝集素購自美國Vector Labs公司；兔抗人促紅細胞生成素多抗 (AB-286-NA) 購自美國 R&D公司；辣根過氧化物酶 (HRP) 標記山羊抗兔 IgG(ZB-2301) 由北京中杉金橋公司進口分裝；Bradford法檢測蛋白總量試劑盒購自中國天根公司；LDH檢測試劑盒購自南京建成生物研究所；四甲基傘形酮唾液酸 (4MU-Neu5Ac) 購自上海百靈威公司。

1.2 方法

1.2.1 CHO細胞的靜置培養(yǎng)

在T-175方瓶內(nèi)接種CHO細胞，接種密度約為 5×104cells/mL，生長階段使用添加 10%NBCS的DMEM/F12培養(yǎng)基將CHO細胞培養(yǎng)至約100%融合，使用無菌PBS沖洗2次后，更換為生產(chǎn)用高糖無血清培養(yǎng)基 CHO-S-SFMⅡ，培養(yǎng)基中添加0.5 mmol/L正丁酸鈉，設置2個重復，每隔3 d收集培養(yǎng)上清，更換新鮮培養(yǎng)基，無血清培養(yǎng)至第9天結束。

1.2.2 CHO細胞在生產(chǎn)階段的生長動力學

參照文獻[13]，在24孔板內(nèi)接種CHO細胞，接種密度及培養(yǎng)方式與方瓶中相同，每天臺盼藍染色后使用血球計數(shù)板計數(shù)平行 3孔的活細胞數(shù)，繪制細胞在無血清生產(chǎn)階段的生長曲線。

1.2.3 超濾培養(yǎng)上清及PNGase F酶消化

取1 mL培養(yǎng)上清，12 000 r/min離心5 min，去除細胞碎片，倒入4 mL (10 kDa) 規(guī)格的超濾離心管 (Millipore，USA)，再加入20 mmol/L 磷酸緩沖液 (pH 7) 至滿，離心至剩下0.2～0.5 mL，離心條件為5 000× g (g為重力加速度)，10 min，再加入20 mmol/L 磷酸緩沖液 (pH 7) 至滿，離心至剩下0.2～0.5 mL，重復2次，即共用約12 mL磷酸緩沖液換相，最后剩0.2～0.4 mL左右，達到脫鹽和濃縮的目的。取部分超濾后的樣品使用PNGase F酶或α-2,3唾液酸酶處理，方法詳見試劑說明書，對處理后的樣品進行超濾脫鹽。

1.2.4 等電聚焦與轉(zhuǎn)膜印記

使用等電聚焦結合擴散轉(zhuǎn)膜印記方法[14]對超濾后的培養(yǎng)上清樣品及 PNGase F酶或 α-2,3唾液酸酶處理后的樣品進行檢測。

1.2.5 凝集素共沉淀

使用凝集素共沉淀方法檢測培養(yǎng)上清中rhEPO糖鏈分枝末端唾液酸占有率。使用Bradford法檢測培養(yǎng)方瓶培養(yǎng)CHO細胞上清中蛋白總量，蛋白定量方法參照試劑盒說明書。取不同時期的培養(yǎng)上清，控制相同的 rhEPO含量(～2 μg)，加入 NBCS，使蛋白總量達到 20 μg，加入100 μg RCA-I凝集素，使用PBS將總體積補齊至100 μL。將反應體系于4 ℃放置48 h；放置后，將體系在4 ℃條件下以14 000 r/min離心10 min，將沉淀使用預冷的PBS洗2遍，而后對蛋白樣品進行SDS-PAGE和Western blotting。

1.2.6 乳酸脫氫酶 (LDH) 和唾液酸酶的活性測定

培養(yǎng)上清中 LDH活性檢測方法參照相應試劑盒說明書。采用以下方法測定培養(yǎng)上清中唾液酸酶的活性[15]：使用384孔板 (Greiner Bio-One,Germany)，100 μL 反應體系，樣本：25 μL 4 mmol/L 4MU-Neu5Ac 溶液，75 μL 培養(yǎng)上清；對照：25 μL 4 mmol/L 4MU-NeuAc 溶液，75 μL無血清培養(yǎng)基；標準：100 μmol/L 4MU溶液，充分混合體系，使用Fluoroskan Ascent FL化學發(fā)光儀 (Thermo Fisher Scientific, USA) 自動程序，37 ℃溫育1 h后進行檢測，激發(fā)光為355 nm，散射光為460 nm。

2 結果與分析

2.1 N-糖鏈變化造成CHO細胞所生產(chǎn)rhEPO質(zhì)量降低

等電聚焦結果如圖1所示。靜置培養(yǎng)條件下，早期無血清培養(yǎng)CHO細胞生產(chǎn)的rhEPO質(zhì)量是較好的，集中在酸端，到培養(yǎng)中期，堿端的條帶增加，但是酸端的部分依然存在，到培養(yǎng)后期，酸端的部分條帶消失，堿端的條帶增多，蛋白聚體增多。不同時期所生產(chǎn)的rhEPO被PNGase F酶切除N-糖鏈后，等電聚焦結果條帶分布基本相同，說明培養(yǎng)過程中rhEPO的等電點分布的變化是由N-糖基化水平的變化引起的，同時也可以排除蛋白降解或O-糖鏈變化等其他因素造成不同培養(yǎng)時期的rhEPO蛋白的等電點差異的可能性。

圖1 rhEPO樣品固相pH梯度等電聚焦印跡結果Fig. 1 Immobilized pH gradients isoelectric focusing(IPG-IEF) analysis of rhEPO samples.

2.2 N-糖鏈末端的唾液酸占有率降低導致CHO細胞所生產(chǎn)rhEPO品質(zhì)降低

對阿華生物公司生產(chǎn)的 rhEPO原液和方瓶培養(yǎng)CHO細胞獲得的不同時期的培養(yǎng)上清進行凝集素免疫沉淀。離心后將沉淀與上清同時進行SDS-PAGE和Western blotting，結果如圖2所示。rhEPO原液和培養(yǎng)早期的上清里的 rhEPO蛋白沒有出現(xiàn)在沉淀中，rhEPO蛋白都只出現(xiàn)在培養(yǎng)上清中，到培養(yǎng)中期，沉淀中出現(xiàn)rhEPO蛋白，培養(yǎng)后期有更多的rhEPO沉淀，說明方瓶培養(yǎng)過程中rhEPO的N-糖鏈末端的半乳糖逐漸暴露。因此rhEPO蛋白在方瓶培養(yǎng)后期唾液酸含量降低的一個重要原因是N-糖鏈末端沒有全部結合唾液酸。從圖2中還可以看到，隨著培養(yǎng)時間的延長，rhEPO蛋白的分子量逐漸降低，之前的IEF實驗已經(jīng)證明培養(yǎng)過程中沒有蛋白降解的影響，因此是蛋白N-糖基化的改變使rhEPO的分子量下降。

2.3 CHO細胞培養(yǎng)過程中細胞活性的變化

對方瓶無血清培養(yǎng)的CHO細胞上清中的乳酸脫氫酶 (LDH) 活性進行檢測，結果如圖3所示。從圖中可以看到，隨著培養(yǎng)時間延長，胞外LDH活性逐漸升高，細胞活性逐漸降低。這與無血清培養(yǎng)基中該株細胞的生長曲線所顯示的細胞活性變化一致 (圖 4)，隨著生產(chǎn)時間的延長，貼附的活細胞數(shù)量逐漸減少。

圖 2 方瓶培養(yǎng) CHO 細胞上清凝集素蛋白共沉淀SDS-PAGE和Western blotting結果Fig. 2 SDS-PAGE and Western blotting analysis of rhEPO samples after lectin precipitation.

圖3 靜置培養(yǎng)CHO細胞上清中LDH活性變化Fig. 3 LDH activity in conditioned media of CHO cultured in T-175 flasks.

2.4 唾液酸酶對CHO細胞所產(chǎn)rhEPO存在降解作用

圖4 CHO細胞在CHO-S-SFM II培養(yǎng)基生產(chǎn)階段的生長曲線Fig. 4 Growth curve of CHO cells at production phase in CHO-S-SFM II.

圖5 經(jīng)唾液酸酶處理后CHO培養(yǎng)上清中rhEPO樣品的等電聚焦結果Fig. 5 IPG-IEF results of rhEPO in CHO conditioned media after sialidase digestion.

如圖5所示，使用唾液酸酶對T-175方瓶的無血清培養(yǎng)初期所收獲的rhEPO進行處理，處理后，rhEPO的等電點分布發(fā)生變化，酸端條帶減少，說明唾液酸酶會對該株 CHO細胞所產(chǎn)的rhEPO上的唾液酸產(chǎn)生降解作用。

2.5 CHO細胞培養(yǎng)過程中上清中唾液酸酶活性變化

對方瓶培養(yǎng)的CHO細胞上清中的唾液酸酶酶活性進行檢測，結果見圖6。在培養(yǎng)過程中，更換為無血清培養(yǎng)基后，培養(yǎng)上清中的唾液酸酶活性逐漸升高，到培養(yǎng)中后期，培養(yǎng)基中的唾液酸酶活性穩(wěn)定存在。

圖6 靜置培養(yǎng)CHO上清中唾液酸酶酶活性變化Fig. 6 Sialidase activity in supernatant of CHO cultured in T-175 flasks.

3 討論

重組人 EPO的一級結構與天然蛋白沒有差別，肽鏈部分包含166個氨基酸殘基，糖成分約占EPO分子量的40%。糖基在EPO蛋白所占比例較大，對 EPO蛋白的性質(zhì)和功能也有很大影響[16]。對于 rhEPO蛋白，糖基化后形成的唾液酸豐度會顯著影響 rhEPO蛋白在人體內(nèi)的半衰期，所以生產(chǎn)中質(zhì)量控制的一個重要環(huán)節(jié)就是對rhEPO唾液酸豐度的檢測，大量不符合標準的蛋白會被丟棄。生產(chǎn)糖蛋白類藥物的過程中，很多生物、化學或物理的參數(shù)會影響產(chǎn)品的糖基化形態(tài)，糖基化的通路復雜而且被嚴格調(diào)控，這使得控制蛋白的糖基化并不是一件簡單的事[17]。了解培養(yǎng)過程中的各種因素對糖基化的影響，有助于改善工藝條件，保持理想的糖基化形態(tài)和蛋白產(chǎn)品質(zhì)量的穩(wěn)定性。

CHO細胞被廣泛用于重組蛋白藥物的生產(chǎn)，一個重要原因是其糖基化修飾與人類相似，表達的蛋白適于人體使用[18-19]，但是糖基化相關的酶對于CHO細胞的生存不是必需的，所以在沒有環(huán)境壓力的條件下，糖基化相關基因發(fā)生突變的CHO細胞大量存在，不同的CHO細胞株對重組蛋白的糖基化修飾能力存在差異，甚至同一株CHO細胞在經(jīng)過傳代后也會變?yōu)橐蝗壕哂胁煌腔揎椖芰Φ募毎募?，所產(chǎn)蛋白的糖基化修飾程度也就產(chǎn)生了差異[20]。所以，在無血清培養(yǎng)初期，細胞狀態(tài)較好的條件下，我們考察了所研究的工程細胞株是否可以表達高唾液酸含量的rhEPO產(chǎn)品，以證明該細胞株是否存在糖基化酶的缺陷。

通過等電聚焦的方法，我們可以直觀地展示培養(yǎng)過程中細胞所生產(chǎn) rhEPO的等電點變化情況，在培養(yǎng)初期，該細胞株可以表達高唾液酸含量的rhEPO，這說明該細胞株具備完整的N-糖基化修飾系統(tǒng)，但是隨著培養(yǎng)時間的延長，蛋白N-糖鏈的修飾發(fā)生變化，而這種變化是由于外部環(huán)境的改變引起的，這些環(huán)境因素一方面可能影響細胞內(nèi)的N-糖基化通路，一方面可能直接作用于胞外的蛋白產(chǎn)品。

血清可以提供細胞生長所需要的營養(yǎng)，但是由于其成分的不確定性，不能被應用于重組蛋白的生產(chǎn)，雖然無血清培養(yǎng)基可以取代血清的作用，但是細胞往往需要經(jīng)過適應才能在無血清培養(yǎng)基中正常生長和代謝[21]。CHO-S-SFMⅡ是一種商業(yè)化培養(yǎng)基，在營養(yǎng)成分方面存在一定的缺陷[22]，本研究中的細胞株由于工藝要求，在有血清培養(yǎng)后直接轉(zhuǎn)換至 CHO-S-SFMⅡ中培養(yǎng)，培養(yǎng)環(huán)境的變化是造成細胞大量死亡的主要原因。

在細胞培養(yǎng)過程中，CHO胞內(nèi)的糖苷酶會由于細胞分泌或者細胞裂解而被釋放到胞外。Gramer和Goochee[15]發(fā)現(xiàn)CHO細胞上清中存在4種糖苷酶的活性，其中唾液酸酶積累在胞外培養(yǎng)基內(nèi)，并且在pH為7的條件下仍保持一定的活性。這種現(xiàn)象是否存在于我們的培養(yǎng)過程中，也是我們關注的問題之一。

凝集素共沉淀的結果表明，培養(yǎng)過程中rhEPO糖基化修飾的變化是由于rhEPO蛋白N-糖鏈末端的唾液酸含量下降造成的，N-糖鏈末端的半乳糖逐漸暴露，說明隨著培養(yǎng)時間的延長，rhEPO蛋白上N-糖鏈的天線數(shù)目逐漸多于其末端的唾液酸數(shù)目，這可能是由于唾液酸沒有連接到糖鏈上或連接后被切除造成的。培養(yǎng)過程中細胞的活性逐漸降低，死亡的細胞所釋放的唾液酸酶在胞外積累，這些唾液酸酶的降解作用會對胞外rhEPO唾液酸含量的降低做出貢獻。

結合上述發(fā)現(xiàn)，我們可以采用相同的方法對工業(yè)生產(chǎn)過程中該株細胞所生產(chǎn)的rhEPO的N-糖基化變化規(guī)律及影響因素進行研究，考察灌注培養(yǎng)模式下該株細胞是否會釋放唾液酸酶到胞外并對產(chǎn)品的唾液酸含量產(chǎn)生影響，為進一步研究打下了基礎。

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June 16, 2012; Accepted: September 27, 2012

Zhiwei Song. Tel: +86-65-64070844; Fax: +86-65-96220671; E-mail: song_zhiwei@bti.a-star.edu.sg Yuanxing Zhang. Tel: +86-21-64253065; Fax: +86-21-64253025; E-mail: yxzhang@ecust.edu.cn

國家新藥創(chuàng)制重大專項 (No. 2009ZX09503-013)，上海市重點學科 (No. B505) 資助。

Extracellular sialidase degrades sialic acid in recombinant human erythropoietin produced by an industrial Chinese hamster ovary cell strain

Yingwei Liu1, Xiangshan Zhou1, Haifeng Liu1,3, Zhiwei Song2, and Yuanxing Zhang1

1State Key Laboratory of Bioreactor Engineering, East China University of Science and Technology, Shanghai200237,China
2Bioprocessing Technology Institute, Agency for Science, Technology and Research, Singapore138668,Singapore
3E-hua Biotech Pharmaceutical Co.,Ltd., Dong’e252201, Shandong, China

To investigate theN-glycosylation characteristics of recombinant human erythropoietin (rhEPO) produced by an industrial Chinese hamster ovary (CHO) cell line that is currently used in a large scale manufacturing process, we cultured this cell strain in static mode. The produced rhEPO in the culture supernatant was analyzed using isoelectric focusing (IEF) andRicinus communisagglutinin-I (RCA-I) lectin precipitation. The lactate dehydrogenase (LDH) and sialidase activity in the serum-free supernatant were assayed as well. The analyses revealed that this cell strain could produce rhEPO with high sialic acid content, but during prolonged culture, cell viability decreased with time whilst the activity of sialidase present in the supernatant increased. The loss in rhEPO quality was due to a decrease in terminal sialic acid on theN-glycans, caused by sialidase degradation. The methods and findings in this paper serve as basis for further investigation of industrial production process.

Chinese hamster ovary cell strain, recombinant human erythropoietin,N-glycosylation, cell viability, sialidase

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Supported by: National Special Project of Key Technology of China (No. 2009ZX09503-013), Shanghai Leading Academic Discipline Project(No. B505).