不同品種丁香葉中蘆丁及丁香苦苷的含量測(cè)定

于淼1 孟繁穎1 蘇瑞2趙宏博1崔培珅1方洪壯1

（1佳木斯大學(xué)藥學(xué)院，黑龍江佳木斯154007；2哈爾濱市第一醫(yī)院藥劑科，黑龍江哈爾濱150010）

藥用丁香葉為木樨科丁香屬植物紫丁香（Syringa oblata Lindl.）、 朝 鮮 丁 香 （Syringa diatata Naka.）和洋丁香（Syringa vulgaris L.）的干燥葉[1]，具有廣譜抗菌、抗病毒等作用，主要用于治療腸炎、急性痢疾、黃疸型肝炎、乙型肝炎、結(jié)膜炎等[2-3]。常見(jiàn)的丁香屬植物還有暴馬丁香（Syringa reticulata（Blume）Hara.）、關(guān)東丁香（Syringa velutina Kom.）、小 葉 丁 香 （Syringa microphylla Diels.）、紅 丁 香（Syringa villosa Vahl.）和什錦丁香（Syringa chinensis Willd.）等。丁香屬植物中含有多種具有藥用活性的化學(xué)成分[4-5]，其中蘆丁具有清除自由基、抗脂質(zhì)過(guò)氧化、舒張血管及影響藥物代謝酶活性等作用[6-7]；丁香苦苷具有清除氧自由基、抗菌消炎、抗病毒、降壓、降溫、鎮(zhèn)咳祛痰等作用[8]。為完善丁香葉藥材的質(zhì)量控制，探索擴(kuò)展丁香葉的藥用資源，本研究建立多波長(zhǎng)同時(shí)測(cè)定丁香葉中蘆丁及丁香苦苷含量的高效液相色譜法（HPLC），并對(duì)7個(gè)品種丁香葉進(jìn)行了含量測(cè)定。在定量色譜峰的確認(rèn)上，采用化學(xué)計(jì)量學(xué)中的光譜相關(guān)色譜法[9-11]，處理丁香葉 HPLC-二極管陣列檢測(cè)器（DAD）的二維數(shù)據(jù)獲取準(zhǔn)確的定性信息。結(jié)果表明，所建立的HPLC法可用于丁香葉中蘆丁及丁香苦苷的測(cè)定，方法準(zhǔn)確可靠、靈敏度高；不同品種的丁香葉中都含有蘆丁，蘆丁及丁香苦苷含量在不同的丁香葉中均有較大的差異。

1 儀器與試藥

Agilent 1200系列高效液相色譜儀（美國(guó)安捷倫公司），包括G1311A四元泵，G1322真空脫氣機(jī)，G1329自動(dòng)進(jìn)樣器，G1315DAD檢測(cè)器；BP211D電子天平（德國(guó)賽多利斯公司）。

蘆丁對(duì)照品（天津一方科技有限公司，批號(hào)：20070824）；丁香苦苷對(duì)照品（上海順勃生物工程技術(shù)有限公司，批號(hào)：20091009）；丁香葉樣品為2010年7月采自哈爾濱植物園7種有分類標(biāo)識(shí)的丁香樹(shù)的樹(shù)葉；流動(dòng)相乙腈、甲醇為色譜純；其他試劑為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18色譜柱（4.6 mm × 250 mm，5 μm）及保護(hù)柱（4.6 mm ×12.5 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈-0.1%磷酸水（20∶80），流速 1.0 mL/min；定性分析時(shí)，檢測(cè)波長(zhǎng)為200～400 nm，波長(zhǎng)間隔2 nm；蘆丁定量分析檢測(cè)波長(zhǎng)為255 nm，丁香苦苷225 nm；柱溫為室溫；進(jìn)樣量10 μL；理論塔板數(shù)按蘆丁峰計(jì)算不少于6 000，丁香葉中蘆丁、丁香苦苷的色譜分離結(jié)果符合定量要求。

2.2 溶液制備

2.2.1 供試品溶液的制備 取經(jīng)60℃減壓干燥的丁香葉粉末約1.0 g（過(guò)60目篩），精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%乙醇 50 mL，稱定重量，加熱回流1 h，放冷，再稱定重量，用70%乙醇補(bǔ)足減失重量，搖勻，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液。

2.2.2 對(duì)照品溶液的制備 取蘆丁對(duì)照品和丁香苦苷對(duì)照品適量，精密稱定，分別用甲醇制成每1 mL含0.25 mg的蘆丁對(duì)照品儲(chǔ)備液和每1 mL含1.25 mg的丁香苦苷對(duì)照品儲(chǔ)備液。避光、冷藏。

2.3 色譜法定性

取供試品溶液及由蘆丁、丁香苦苷對(duì)照品溶液制得的混合對(duì)照品溶液，分別按2.1項(xiàng)定性條件進(jìn)行測(cè)定。不同品種丁香葉與對(duì)照品的225 nm和255 nm HPLC圖見(jiàn)圖1。由圖1可知，蘆丁和丁香苦苷對(duì)照品色譜峰的保留時(shí)間分別為6和17 min。提取對(duì)照品色譜峰處的200～400 nm的數(shù)據(jù)，作為標(biāo)準(zhǔn)光譜，分別計(jì)算其與不同品種丁香葉色譜保留時(shí)間部分區(qū)間二維數(shù)據(jù)中的光譜間的相關(guān)系數(shù)，并繪制相應(yīng)的光譜相關(guān)色譜曲線[10]，確定用于定量的色譜峰。其中，紫丁香葉和什錦丁香葉中蘆丁、丁香苦苷的光譜相關(guān)色譜曲線見(jiàn)圖2。

圖1 不同品種丁香葉中蘆丁（1）、丁香苦苷（2）的255 nm 色譜圖（A）與 225 nm 色譜圖（B）

2.4 線性關(guān)系、檢測(cè)限和定量限

圖2 蘆丁、丁香苦苷的光譜相關(guān)色譜曲線

精密量取蘆丁、丁香苦苷對(duì)照品溶液各0.50、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0 mL，分別置 10 mL 的不同量瓶中，加甲醇至刻度，混勻，制成6個(gè)不同濃度的混合對(duì)照品溶液。按2.1項(xiàng)下定量色譜條件測(cè)定，每個(gè)濃度進(jìn)樣2次，取其峰面積平均值Y為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣量 X（μg）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程。蘆丁和丁香苦苷分別在0.125 0～2.000 μg 和 0.625 0 ～ 10.000 μg 的 范圍 內(nèi)線 性關(guān)系良好，結(jié)果見(jiàn)表1。取蘆丁、丁香苦苷對(duì)照品溶液，用甲醇逐步稀釋成不同濃度的對(duì)照品溶液，分別進(jìn)樣10 μL，取信噪比S/N=3時(shí)的濃度為最低檢測(cè)限，S/N=10時(shí)的濃度為最低定量限。蘆丁、丁香苦苷的最低檢測(cè)限和最低定量限見(jiàn)表1。

表1 丁香葉藥材中蘆丁、丁香苦苷的標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢測(cè)限和定量限

2.5 精密度試驗(yàn)

選取用于制備標(biāo)準(zhǔn)曲線中的3個(gè)不同濃度混合對(duì)照品溶液（含蘆丁濃度分別為0.05、0.10、0.15 mg/mL；含丁香苦苷濃度分別為 0.25、0.50、0.75 mg/mL）。每個(gè)濃度連續(xù)進(jìn)樣 6次，記錄蘆丁和丁香苦苷色譜峰的峰面積值，以峰面積計(jì)算RSD（n=6）分別小于 0.49%、0.49%、0.48%和 0.42%、0.40%、0.41%，表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一份供試品溶液，分別于 0、2、4、6、8、12、24 h進(jìn)樣，記錄色譜峰面積。結(jié)果蘆丁峰面積的RSD為0.95%，丁香苦苷峰面積的RSD為0.35%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

取紫丁香葉6份，按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別在上述色譜條件下進(jìn)行測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算含量。結(jié)果樣品中蘆丁的RSD為1.6%；丁香苦苷的RSD為2.1%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.8 回收率試驗(yàn)

取已知含有量的紫丁香葉粉末9份，各約0.1 g，精密稱定，每3份為1組。每組按蘆丁和丁香苦苷含有量的 120%、100%、80%3個(gè)目標(biāo)質(zhì)量，分別精密加入適量的蘆丁和丁香苦苷的對(duì)照品溶液，按2.2項(xiàng)下方法平行制備成高、中、低3個(gè)濃度的供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，計(jì)算回收率。蘆丁和丁香苦苷的平均回收率分別為99.9%和99.4%，RSD分別為1.4%和1.1%。

2.9 樣品含量測(cè)定

取不同品種丁香葉粉末各3份，每份1 g，精密稱定，按 2.2項(xiàng)下方法制成供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，用外標(biāo)法測(cè)定計(jì)算蘆丁和丁香苦苷的含量。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 不同品種丁香葉中蘆丁和丁香苦苷的含量（mg/g，n=3）

由表2可知，7種丁香葉中蘆丁和丁香苦苷的含有量均差異較大，其中，丁香苦苷的差別更為明顯。7種丁香葉中均含有蘆丁，以洋丁香、小葉丁香和什錦丁香的含量較高；丁香苦苷在紫丁香葉中含量最高，且在小葉丁香、關(guān)東丁香、暴馬丁香和紅丁香中未檢測(cè)到。

3 討論

3.1 色譜條件的選擇上，比較了等度洗脫條件下的不同比例的甲醇-磷酸水、甲醇-乙腈-磷酸水及乙腈-磷酸水體系，結(jié)果以乙腈-磷酸水分離效果最佳；也比較了0.1%、0.2%和0.3%3個(gè)不同濃度的磷酸水，結(jié)果未見(jiàn)磷酸的濃度對(duì)分離結(jié)果有影響，故最終選定流動(dòng)相為乙腈-0.1%磷酸水（20∶80）。另外，對(duì)供試品溶液及對(duì)照品溶液的蘆丁和丁香苦苷色譜峰DAD檢測(cè)結(jié)果表明，蘆丁與丁香苦苷的紫外光譜的最大吸收分別為255 nm和225 nm。為增加方法的靈敏度，采用了多波長(zhǎng)同時(shí)檢測(cè)方法[12]，在255 nm測(cè)定蘆丁，在225 nm測(cè)定丁香苦苷。

3.2 供試品溶液制備時(shí)，當(dāng)提取溶液量（50 mL）不變，丁香葉粉末量分別為 0.1、0.5、1.0 g時(shí)，樣品的提取率不受影響?；诖私Y(jié)果，回收率試驗(yàn)時(shí)，選用的樣品量為0.1g而非通常的樣品測(cè)定時(shí)的1/2量（0.5 g），以節(jié)省對(duì)照品的加入量。

3.3 丁香苦苷作為丁香葉藥材的主要有效物質(zhì)的文獻(xiàn)報(bào)道較多，而未見(jiàn)丁香葉中蘆丁含量測(cè)定的報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)中曾對(duì)山梅花屬植物西南丁香葉進(jìn)行了測(cè)定，西南丁香葉中也含有蘆丁，且含有量高于實(shí)驗(yàn)所涉及的7種丁香屬植物。

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