HPLC測(cè)定壯骨沖劑中補(bǔ)骨脂素的含量

陳良勝

（河南新縣人民醫(yī)院，河南 信陽(yáng)465550）

HPLC測(cè)定壯骨沖劑中補(bǔ)骨脂素的含量

陳良勝

（河南新縣人民醫(yī)院，河南 信陽(yáng)465550）

目的：建立高效液相色譜法（HPLC）壯骨沖劑補(bǔ)骨脂素含量測(cè)定的方法。方法：Hypersil BDS C18色譜柱（4.6mm×200mm，5μm），流速1.2m L/m in，流動(dòng)相：甲醇-水（40∶60），進(jìn)樣量10μL，理論板數(shù)不低于3 000（按補(bǔ)骨脂素峰計(jì)），柱溫30℃，檢測(cè)波長(zhǎng)246 nm。結(jié)果：補(bǔ)骨脂素在0.201 8～0.706 4μg范圍內(nèi)呈良好線性（r=0.999 7），平均回收率為102.57%，RSD=1.93%。結(jié)論：該方法準(zhǔn)確可靠、簡(jiǎn)便、快速、重復(fù)性好。

壯骨關(guān)節(jié)丸是治療退行性骨關(guān)節(jié)病常用中藥復(fù)方制劑。近年來(lái)涉及壯骨關(guān)節(jié)丸的藥品不良反應(yīng)（ADR）報(bào)告數(shù)量呈增長(zhǎng)趨勢(shì)。ADR表現(xiàn)主要為皮疹、瘙癢，惡心、嘔吐、腹痛、腹瀉、胃痛，血壓升高，肝功能異常，其中肝損害表現(xiàn)最為多見。為此，本院臨床醫(yī)師、藥師以及相關(guān)制劑人員對(duì)壯骨關(guān)節(jié)丸的處方和制備工藝進(jìn)行改進(jìn)，研制出壯骨沖劑，院內(nèi)協(xié)定處方包括狗脊、淫羊藿、骨碎補(bǔ)、續(xù)斷、補(bǔ)骨脂、桑寄生、雞血藤、當(dāng)歸、木香、乳香、沒藥，具有補(bǔ)益肝腎、養(yǎng)血活血、舒筋活絡(luò)、理氣止痛的功效。用于肝腎不足、血瘀氣滯、脈絡(luò)痹阻所致的骨性關(guān)節(jié)炎、腰肌勞損，癥見關(guān)節(jié)腫脹、疼痛、麻木、活動(dòng)受限等[1]。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

UltiMateTM3000型智能液相色譜儀（美國(guó)戴安公司）；AE240型電子分析天平（Mettler公司）；超聲清洗器（重慶潔美達(dá)超聲波）；SPD-6AV紫外檢測(cè)器（日本島津公司）。

1.2 試藥

補(bǔ)骨脂素對(duì)照品（原中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào) 0739-201007）；壯骨沖劑（本院制劑室），甲醇為色譜純，水為超純水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件：

色譜柱：依利特 Hypersil BDS C18（4.6 mm× 200 mm，5μm），流速：1.2 m L/m in，流動(dòng)相：甲醇-水（40∶60），進(jìn)樣量：10μL；理論板數(shù)不低于3 000（按補(bǔ)骨脂素峰計(jì)）。

2.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的確定

將補(bǔ)骨脂素對(duì)照品溶于流動(dòng)相中，測(cè)定其紫外吸收光譜，測(cè)得最大吸收波長(zhǎng)為246 nm，因此確定檢測(cè)波長(zhǎng)為246 nm。供試品、對(duì)照品及空白對(duì)照色譜分別見圖1。

圖1 補(bǔ)骨脂素對(duì)照品、供試品及空白對(duì)照HPLC

2.3 溶液的制備

2.3.1 對(duì)照品的制備 精密稱取在60℃真空干燥4 h的補(bǔ)骨脂素對(duì)照品，加甲醇制成每1 m L含25μg補(bǔ)骨脂素的溶液，即得。

2.3.2 供試品的制備 取壯骨沖劑樣品約5 g，研細(xì)，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇100 m L，密塞，稱定重量，超聲處理（功率300W，頻率40 kHz）30 m in，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4 提取條件的選擇

2.4.1 提取方法的考察 經(jīng)文獻(xiàn)檢索[2-4]，補(bǔ)骨脂素在甲醇、乙酸乙酯中的溶解性較好，分別采用超聲和回流方法，比較2種溶劑對(duì)補(bǔ)骨脂素提取率的影響。

2.4.1.1 乙酸乙酯回流/超聲提取 取壯骨沖劑樣品約 5 g，研細(xì)，精密稱定，用乙酸乙酯回流或超聲提取4次，每次40 m L，每次30 m in。分別將每次提取液濾過，蒸干，殘?jiān)眉状既芙?，轉(zhuǎn)移至50 m L容量瓶中，并稀釋至刻度，搖勻，0.45μm濾膜過濾，進(jìn)樣。

2.4.1.2 甲醇回流/超聲提取 取壯骨沖劑樣品約5 g，研細(xì)，精密稱定，用甲醇回流或超聲提取4次，每次40 m L，每次30 m in。分別將每次提取液濾過，蒸干，殘?jiān)眠m量甲醇溶解后，分別定量轉(zhuǎn)移至50 m L容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，0.45μm濾膜過濾，進(jìn)樣。結(jié)果見表1。

表1 不同提取方法對(duì)補(bǔ)骨脂素提取率的影響

結(jié)果顯示，乙酸乙酯超聲和回流對(duì)補(bǔ)骨脂素的提取效果較差，甲醇超聲和回流結(jié)果相當(dāng)，選擇方法較簡(jiǎn)單的甲醇超聲提取補(bǔ)骨脂素。

2.4.2 提取溶劑及用量的考察[5-7]壯骨沖劑樣品（批號(hào)1002011），經(jīng)甲醇超聲提取4次，補(bǔ)骨脂素基本提取完全，含量為0.412 0 mg/g。甲醇超聲提取4次，方法較繁瑣，考慮加大溶劑用量，超聲提取1次。稱取兩份樣品，分別考察提取溶劑甲醇用量為80、100、120 m L，超聲處理 30 min，對(duì)補(bǔ)骨脂素提取率的影響。取本品約5 g，研細(xì)，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入一定量的甲醇，密塞，稱定重量，超聲處理（功率300W，頻率40 kHz）30 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。結(jié)果見表2。

表2 甲醇用量對(duì)超聲處理?xiàng)l件下補(bǔ)骨脂素提取率的影響

結(jié)果顯示，提取溶劑為100 m L，超聲30 m in，補(bǔ)骨脂素的提取率約92%，補(bǔ)骨脂素基本提取完全，滿足含量測(cè)定要求，確定提取溶劑用量為100m L，提取次數(shù)為1次，超聲時(shí)間為30 m in。

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 線性關(guān)系考察 精密稱取補(bǔ)骨脂素對(duì)照品5.046 mg，置10 m L量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度。分別精密量取0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4m L分別置10 m L量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻。分別精密吸取10μL于注入液相色譜儀，測(cè)定其峰面積。以峰面積值積分值（Y）對(duì)進(jìn)樣量（X）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程：

結(jié)果表明，在0.201 8～ 0.706 4μg范圍內(nèi)，補(bǔ)骨脂素對(duì)照品和峰面積呈良好線性關(guān)系。

2.5.2 精密度試驗(yàn) 精密量取對(duì)照品溶液，照含量測(cè)定方法連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定補(bǔ)骨脂素峰面積積分平均值為22.831 6，RSD=0.67%，說明精密度良好。

2.5.3 重復(fù)性試驗(yàn) 按擬定的含量測(cè)定方法，取同一批樣品（批號(hào)：1002011），分別按 2.3.2項(xiàng)下操作，制備6份供試品溶液，測(cè)定補(bǔ)骨脂素的含量，分別為0.375 5、0.377 0、0.381 5、0.369 0、0.373 5、0.363 8 mg/g。結(jié)果，補(bǔ)骨脂素含量平均值為0.373 4 mg/g，RSD=1.67%，表明重復(fù)性良好。

2.5.4 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取含量的同一批號(hào)（批號(hào)：1002031，含量0.373 4mg/g）的樣品2.5 g，分別精密加入0.100 1 mg/m L補(bǔ)骨脂素對(duì)照品溶液各10 m L，再精密加入甲醇90 m L，密塞，稱定重量，超聲處理（功率300W，頻率40 kHz）30 m in，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。計(jì)算補(bǔ)骨脂素總量，并由下列公式計(jì)算回收率，結(jié)果見表3。

表3 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

回收率（%）=（測(cè)出補(bǔ)骨脂素總量－供試品中補(bǔ)骨脂素的含量）/加入補(bǔ)骨脂素的量×100%

結(jié)果顯示，本方法準(zhǔn)確度良好。

2.5.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)[9-10]精密吸取供試品溶液（批號(hào)：1002011）分別在 0、2、4、6、8、10、12 h進(jìn)樣，記錄峰面積，結(jié)果補(bǔ)骨脂素峰面積的RSD=1.04%，表明供試品溶液12 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

3 樣品含量測(cè)定

取10批樣品，按上述方法測(cè)定其補(bǔ)骨脂素的含量，每批樣品制備6份，每份重復(fù)進(jìn)樣2次，測(cè)定結(jié)果見表4。

表4 補(bǔ)骨脂素含量測(cè)定結(jié)果

4 結(jié)論

本研究采用HPLC測(cè)定壯骨沖劑中補(bǔ)骨脂素的含量，該方法準(zhǔn)確可靠，簡(jiǎn)便、快速、重復(fù)性好。

[1]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典（2010年版）一部[S].北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010.

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The Content Determ ination of Psoralen in Zhuanggu Electuary by HPLC

Chen Liangsheng(The People’s Hospital of Xin County of Henan Province,Henan Xinyang 465550,China)

Objective:To establish a method for the content determ ination of psoralen in zhuanggu electuary by HPLC.M ethods:The Hypersil BDS C18chromatographic column（4.6 mm×200 mm，5μm）was used.The flow rate was 1.2 m L/m in，the mobile phase wasmethanol-water （40∶60），the sample size was 10μL，the theoretical plate number was not less than 3 000 (according to psoralen peak meter)，the column temperature was at 30℃，and the detection wavelength was at 246 nm.Results:There was a good linear relationship w ithin the range of 0.201 8～0.706 4μg for psoralen（r=0.999 7）.The average recovery was 102.57% (RSD=1.93%).Conclusion:This method was proved accurate，reliable，simple and fastw ith a good repeatability.

HPLC；Zhuanggu Electuary；Psoralen；Content Determ ination

10.3969/j.issn.1672-5433.2012.11.009

2011-12-21）

陳良勝，男，主管藥師。研究方向：醫(yī)院藥學(xué)。E-mail：wpcy56@tom.com

【關(guān)鍵詞】 高效液相色譜法；壯骨沖劑；補(bǔ)骨脂素；含量測(cè)定