飼糧中三聚氰胺對(duì)乳成分的影響及其在牛奶中的殘留規(guī)律

趙小偉 哈斯額爾敦 王加啟，* 卜登攀 魏宏陽(yáng) 周凌云 王 俊 許曉敏

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，蘭州 730070;2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所反芻動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)研究室，北京 100193;3.農(nóng)業(yè)部奶及奶制品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心(北京)，北京 100193)

三聚氰胺(melamine)，學(xué)名 1，3，5 － 三嗪 －2，4，6 －三胺，化學(xué)式 C3H6N6，酸度系數(shù)(pKa)為5.0，相對(duì)分子質(zhì)量為 126.12，是一種三嗪類(lèi)含氮雜環(huán)有機(jī)化合物(圖1)，是尿素后加工產(chǎn)品，主要用作生產(chǎn)三聚氰胺甲醛樹(shù)脂(MF)的原料［1］。三聚氰胺含氮量高達(dá)66%，早期的毒性研究認(rèn)為，三聚氰胺對(duì)哺乳動(dòng)物表現(xiàn)為低毒［2］。有研究在肉牛和綿羊的飼糧中添加三聚氰胺作為非蛋白氮，試圖提高飼料效價(jià)，結(jié)果表明，盡管三聚氰胺在反芻動(dòng)物瘤胃內(nèi)可部分水解(＜20%)，但其總氮利用效率并不理想［3－4］。而三聚氰胺在奶牛體內(nèi)的代謝規(guī)律以及是否有向牛奶遷移的現(xiàn)象尚未得到充分研究考證。奶牛泌乳的生理特點(diǎn)決定了血乳屏障能夠快速過(guò)濾血液、攝取泌乳所需的組分，因此認(rèn)為乳成分極易受到飼糧因素的調(diào)控［5］。Cruywagen等［6］報(bào)道，飼喂受三聚氰胺污染(相當(dāng)于飼喂17.1 g/d三聚氰胺)的玉米胚芽餅會(huì)使三聚氰胺由飼料中迅速遷移至牛奶中，遷移效率為1.7% ～2.1%。由此可見(jiàn)，飼糧中的三聚氰胺很容易通過(guò)血乳屏障進(jìn)入牛奶。2007年美國(guó)發(fā)生的寵物飼料三聚氰胺事件發(fā)現(xiàn)，生產(chǎn)寵物飼料的副產(chǎn)品(制粒后的碎屑)大量用于豬禽飼料加工中，隨即美國(guó)食品藥品管理局(FDA)對(duì)食用污染飼料的豬禽可食組織進(jìn)行了三聚氰胺殘留檢測(cè)，但檢出結(jié)果比預(yù)計(jì)危害人體健康的上限值低 250 倍之多［2，7－8］。2008年中國(guó)在嬰幼兒奶粉中檢測(cè)出高劑量三聚氰胺，此后更是引起了各國(guó)研究人員對(duì)三聚氰胺毒性研究的重視。同時(shí)，奶牛飼糧中不同添加劑量的三聚氰胺在牛奶中三聚氰胺殘留方面的研究還未見(jiàn)報(bào)道。因此，本試驗(yàn)旨在通過(guò)在泌乳奶牛飼糧中添加不同劑量的三聚氰胺，研究飼料中三聚氰胺向牛奶的轉(zhuǎn)化效率和消失規(guī)律，為研究三聚氰胺的毒性作用提供依據(jù)。

圖1 三聚氰胺化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 Chemical structure of melamine

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物與設(shè)計(jì)

動(dòng)物試驗(yàn)在中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所反芻動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)研究室實(shí)驗(yàn)牛場(chǎng)進(jìn)行。試驗(yàn)選用9頭泌乳中期［泌乳日齡(DIM)為(160±21)d］、健康的中國(guó)荷斯坦奶牛。日飼喂2次(07:00和19:00)，自由飲水;日擠奶2次(06:00和18:00)。參照 NY/T 34—2004《奶牛飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)》［9］，以玉米、豆粕、麥麩、棉籽粕、羊草、苜蓿及玉米青貯為主要原料配制基礎(chǔ)飼糧，試驗(yàn)飼糧為在基礎(chǔ)飼糧中添加 0.1%(MEL1 組)、0.5%(MEL2組)和1.0%(MEL3組)三聚氰胺的飼糧(干物質(zhì)基礎(chǔ);三聚氰胺含量為99.5%，購(gòu)自河南中原大化集團(tuán)有限責(zé)任公司)，飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1。試驗(yàn)期每日稱(chēng)量并記錄每頭奶牛飼喂量和剩料量，用于計(jì)算干物質(zhì)采食量(DMI)。

試驗(yàn)采用完全隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，以產(chǎn)奶量為區(qū)組依據(jù)將奶牛分為3組，每組3頭。對(duì)照組奶牛和試驗(yàn)組奶牛分別飼喂基礎(chǔ)飼糧和試驗(yàn)飼糧。試驗(yàn)預(yù)試期7d，期間只飼喂基礎(chǔ)飼糧;正試期28d，包括持續(xù)飼喂含三聚氰胺的飼糧14d，停喂三聚氰胺后繼續(xù)觀測(cè)14d。在飼喂期開(kāi)始前和第1、3、6、10、14 天以及停喂后的第 1、3、6、10、14 天分別記錄試驗(yàn)?zāi)膛Ｈ张拍虼螖?shù)和尿量，同時(shí)試驗(yàn)期間每日觀察奶牛采食、反芻、排糞和躺臥等行為，出現(xiàn)異常時(shí)進(jìn)行記錄并依據(jù)實(shí)際情況對(duì)癥診治。

1.2 樣品采集

1.2.1 飼料樣品采集

試驗(yàn)開(kāi)始前分別采集飼料樣品，其中混合精料500 g、粗料500 g，進(jìn)行粉碎，過(guò)40目篩，用于測(cè)定水分、粗灰分、粗蛋白質(zhì)(CP)、粗脂肪(EE)、中性洗滌纖維(NDF)、酸性洗滌纖維(ADF)、鈣(Ca)、磷(P)和三聚氰胺含量。

1.2.2 牛奶樣品采集

每日記錄產(chǎn)奶量，牛奶樣品在飼喂三聚氰胺的第12、13、14天連續(xù)采集，并在飼喂期開(kāi)始前和第 1、3、6、10、14 天以及停喂后第 1、3、6、10、14 天采集。樣品采集參照ISO 2008［10］的方法進(jìn)行，采集的牛奶樣品按照早晚實(shí)際產(chǎn)奶量比例(約1.00∶1.12)制備混合樣本。樣本分為 2 份，一份加入防腐劑(0.02%溴硝丙二醇，Sigma公司，美國(guó))，4℃保存，用于測(cè)定乳成分;另一份－20℃保存，備測(cè)三聚氰胺含量。

1.3 樣品檢測(cè)

飼料樣品和牛奶樣品分別在“農(nóng)業(yè)部反芻動(dòng)物飼料安全評(píng)價(jià)中心”和“農(nóng)業(yè)部奶及奶制品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心(北京)”進(jìn)行測(cè)定。

1.3.1 飼料養(yǎng)分測(cè)定

飼料中水分(GB/T 6435—86)、粗灰分(GB/T 6438—92)、CP(GB/T 6432—94)、EE(GB/T 6433—94)、Ca(GB/T 6436—2002)、P(GB/T 6437—2002)含量按照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行測(cè)定［11］。NDF和ADF含量采用Van Soest分析方法測(cè)定，分析過(guò)程中添加了淀粉酶和無(wú)水亞硫酸鈉［12］。

1.3.2 飼料三聚氰胺含量測(cè)定

按照中國(guó)農(nóng)業(yè)部公布的三聚氰胺檢測(cè)方法(NY/T 1372—2007)［13］，采用 Agilent 6890 －5975氣相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC-MS，Agilent公司，美國(guó))進(jìn)行測(cè)定。稱(chēng)取5.0 g樣本至離心管中，加1%的三氯乙酸溶液50 mL，加入2 mL 22 g/L乙酸鉛溶液充分混勻，超聲提取20 min，靜止2 min，取上層提取液約30 mL轉(zhuǎn)入離心管，在10 000 r/min離心5 min。準(zhǔn)確移取10 mL過(guò)混合型陽(yáng)離子固相萃取柱，后用3 mL 15%氨水甲醇溶液洗脫，50℃水浴條件下氮?dú)獯蹈桑瑴?zhǔn)確加入1.0 mL 20% 甲醇水溶液，渦旋混合 1 min，過(guò)0.45 μm微孔濾膜，上機(jī)測(cè)定。

色譜條件:5%苯基二甲聚硅氧烷石英毛細(xì)管柱，30 m × 0.25 mm × 0.25 μm，載氣為 氦 氣(He)，流速1.3 mL/min，不分流進(jìn)樣，進(jìn)樣體積為1 μL，進(jìn)樣溫度250℃，升溫程序?yàn)槠鹗?5℃，持續(xù)1.0 min，以 30℃/min升溫至 300℃，保持2 min，傳輸線溫度為280℃。

表1 飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))Table 1 Composition and nutrient levels ofdiets(DM basis) %

質(zhì)譜條件:原子質(zhì)量范圍為40～450 amu，電子轟擊電離(electron ionization，EI)，電子能量70 eV，容積延遲5 min，四極桿溫度150℃，離子源溫度230 ℃，定性離子 m/z為99、171、327、342，定量離子m/z 327。

1.3.3 乳成分測(cè)定

乳中乳脂率、乳蛋白率、乳糖率、總固形物率、尿素含量、游離脂肪酸含量、酸度、冰點(diǎn)和體細(xì)胞數(shù)(SCC)等用全自動(dòng)乳成分分析儀(Foss Milk-OScanTM，F(xiàn)oss公司，丹麥)測(cè)定。

1.3.4 乳中三聚氰胺含量測(cè)定

綜合USFDA的三聚氰胺檢測(cè)方法［14］和中國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 22388—2008《原料乳與乳制品中三聚氰胺檢測(cè)方法》［15］，采用Waters 2695高效液相色譜儀配Waters 2996型PAD檢測(cè)器(HPLC，Waters公司，美國(guó))進(jìn)行測(cè)定。均勻取樣2.0 mL至離心管中，加1%的三氯乙酸溶液15 mL和乙腈5 mL，混勻，超聲提取 30 min，4℃ 條 件 下8 000 r/min離心10 min，上清液經(jīng)三氯乙酸溶液潤(rùn)濕的濾紙過(guò)濾后，用三氯乙酸溶液定容至25 mL，移取5.0 mL濾液，加入5 mL 水混勻，轉(zhuǎn)移至固相萃取柱，依次用3 mL水和3 mL甲醇洗滌，抽至近干后，用6 mL 15%氨化甲醇溶液洗脫。整個(gè)固相萃取過(guò)程流速不超過(guò)1 mL/min。洗脫液于50℃水浴條件下氮?dú)獯蹈?，殘留物?.0 mL流動(dòng)相定容，渦旋混合 1 min，過(guò) 0.45 μm 微孔濾膜，供高效液相色譜(HPLC)檢測(cè)。

色譜條件:C18 分析柱(5 μm，250 mm ×4.6 mm);流動(dòng)相為2.02 g庚烷磺酸鈉和2.10 g檸檬酸定容至1 L水中，此溶液和乙腈以90∶10比例混合。柱溫為35℃，流速為1.0 mL/min，紫外檢測(cè)器檢測(cè)波長(zhǎng)為240 nm，進(jìn)樣體積為20 μL。

當(dāng)牛奶樣品中三聚氰胺含量HPLC檢測(cè)結(jié)果低于 2 mg/L 時(shí)，采用 GC-MS 方法復(fù)測(cè)［14－15］。

1.4 數(shù)據(jù)分析

統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)采用SAS 8.2軟件MIXED模塊進(jìn)行。模塊中考慮試驗(yàn)牛的隨機(jī)因素，固定因素包括三聚氰胺添加劑量以及添加劑量與飼喂天數(shù)交互作用。在分析奶牛DMI、產(chǎn)奶量和乳成分?jǐn)?shù)據(jù)時(shí)以添加三聚氰胺前的數(shù)據(jù)作為協(xié)變量進(jìn)行協(xié)方差分析，以消除試驗(yàn)牛間個(gè)體差異。最小二乘均數(shù)進(jìn)行Tukey多重比較，顯著水平為P＜0.05。

2 結(jié)果

2.1 飼糧中三聚氰胺對(duì)奶牛生理行為的影響

飼料養(yǎng)分實(shí)測(cè)值列于表1，GC-MS測(cè)定的基礎(chǔ)飼糧三聚氰胺含量低于0.05 mg/kg。

三聚氰胺毒性作用主要體現(xiàn)于對(duì)泌尿系統(tǒng)的損傷，從本試驗(yàn)?zāi)膛Ｐ袨橛^察結(jié)果得知，試驗(yàn)期間各組試驗(yàn)?zāi)膛o(wú)排尿異常。日平均排尿次數(shù)為7次，排尿量為(13.7±3.9)L/d。各組試驗(yàn)?zāi)膛Ｔ诓墒?、飲水、反芻和躺臥等行為方面無(wú)明顯異常。在試驗(yàn)期飼喂至第12天時(shí)MEL2和MEL3組各有1頭試驗(yàn)牛有輕微腹瀉癥狀，分別持續(xù)了2和4d后自然恢復(fù)，其他試驗(yàn)?zāi)膛Ｅ偶S情況無(wú)異常。

2.2 飼糧中添加三聚氰胺對(duì) DMI、產(chǎn)奶量和乳組成的影響

奶牛DMI、產(chǎn)奶量和乳成分列于表2。飼糧添加三聚氰胺顯著提高了奶?？偟獢z入量(P＜0.01)，但乳蛋白含量和產(chǎn)量并未得到提升(P＞0.05)，DMI和產(chǎn)奶量不受飼糧三聚氰胺水平的影響(P＞0.05)。乳脂、乳糖和總固形物含量等乳成分隨飼糧三聚氰胺添加水平的提高無(wú)顯著變化(P＞0.05)，但乳中尿素含量隨三聚氰胺添加水平的提高而顯著上升(P＜0.05)，其中MEL3組顯著高于 MEL1組(P＜0.05)，MEL2組高于 MEL1組，但差異不顯著(P ＞0.05)。

2.3 泌乳奶牛飼糧三聚氰胺在乳中的沉積規(guī)律

由圖2可見(jiàn)，隨著飼糧三聚氰胺含量的增加，牛奶中三聚氰胺含量和產(chǎn)量呈線性增加(P＜0.05)。三聚氰胺在體內(nèi)的流通速率較高，不易在組織中沉積，或者不被多數(shù)組織所吸收。本試驗(yàn)中停喂三聚氰胺后乳中殘留迅速消失(圖3)。停喂后的第1天(－1d)乳中三聚氰胺含量與飼喂期(第3～14天)殘留水平相當(dāng)(P＞0.05)，而后迅速下降，至第3天(－3d)時(shí)，3個(gè)劑量組均僅有微量殘留，而持續(xù)至第6天后三聚氰胺含量均低于GC-MS檢出底限( ＜0.05 mg/L)。

3 討論

3.1 飼糧中三聚氰胺對(duì)奶牛生理行為的影響

以往的毒性試驗(yàn)和消化代謝研究表明，三聚氰胺在哺乳動(dòng)物體內(nèi)表現(xiàn)為低毒。Melnick等［16］將大劑量(2 250～4 500 mg/kg)的三聚氰胺飼喂給小鼠后(13周)沒(méi)有觀察到明顯的中毒現(xiàn)象，但長(zhǎng)期攝入(103周)會(huì)造成生殖、泌尿系統(tǒng)的損害，并可進(jìn)一步誘發(fā)膀胱癌。急性毒性試驗(yàn)表明，大鼠口服三聚氰胺最大耐受量為3 161 mg/kg BW［17］。在早期動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)代謝研究中發(fā)現(xiàn)，三聚氰胺作為非蛋白氮(NPN)，在肉牛瘤胃中可少量水解，而大量隨尿液排出，相對(duì)氮生物效價(jià)(與綿籽比較)僅為27%［6］;而在綿羊試驗(yàn)中，三聚氰胺一定程度上能夠在瘤胃中作為氮源被利用，但對(duì)綿羊腎功能損傷顯著［18－21］。Baynes等［22］通過(guò)斷奶仔豬靜脈注射(6.13 mg/kg BW)三聚氰胺試驗(yàn)得知，血液中三聚氰胺可迅速消失，平均半衰期為 4.04 h，清除率為每小時(shí)0.11 L/kg，認(rèn)為三聚氰胺能夠被腎臟迅速排出，在其他組織中殘留的幾率小。本試驗(yàn)在奶牛飼糧干物質(zhì)中添加0.1% ～1.0%三聚氰胺(給量相當(dāng)于35～350 mg/kg BW)，持續(xù)飼喂14d，從排尿以及采食行為等角度觀察無(wú)腎臟疾病臨床癥狀。這可能與飼喂天數(shù)較短有關(guān)，三聚氰胺易由尿液排出，而緩慢微量沉積于腎臟和輸尿管中［23］。因此少量或短時(shí)采食單一三聚氰胺不易形成泌尿系統(tǒng)結(jié)石［24－25］。此外在諸多毒性研究中均無(wú)三聚氰胺對(duì)動(dòng)物胃腸道功能毒害作用的報(bào)道，而在本試驗(yàn)中奶牛腹瀉個(gè)例的出現(xiàn)，不能排除是由于三聚氰胺對(duì)奶牛胃腸道功能的毒害作用所致，其原因還需進(jìn)一步研究證實(shí)。

表2 飼糧添加三聚氰胺對(duì)奶牛生產(chǎn)性能、乳成分和三聚氰胺在體內(nèi)變化情況的影響Table 2 Effects ofdietary melamine on performance，milk composition and melamine change in body ofdairy cows

3.2 飼糧中添加三聚氰胺對(duì) DMI、產(chǎn)奶量和乳組成的影響

通常情況下，乳中尿素含量可反映牛奶中NPN含量，本試驗(yàn)中奶牛飼糧添加三聚氰胺后乳中尿素含量升高，可能與飼糧中NPN(三聚氰胺)含量升高有直接關(guān)聯(lián)，過(guò)量或無(wú)效的NPN不能被瘤胃微生物水解利用，而被血液攝取，經(jīng)腎臟過(guò)濾，由尿液排出［26］。而血液尿素含量與乳中尿素含量呈正相關(guān)［27－28］，因此可推測(cè)奶牛飼糧中的三聚氰胺在瘤胃或后腸道內(nèi)可部分水解為尿素，隨乳腺上皮細(xì)胞擴(kuò)散至牛奶中排放。在停喂后(14d)奶牛DMI、產(chǎn)奶量和乳組成等在各組間無(wú)顯著差異。

圖2 飼糧三聚氰胺含量與牛奶中三聚氰胺含量的線性擬合圖Fig.2 Linear fit between melamine content indiet and melamine content in milk

圖3 牛奶三聚氰胺含量隨飼喂三聚氰胺飼糧以及停喂后隨天數(shù)的動(dòng)態(tài)變化Fig.3 Dynamic changes of melamine content in milk with withdays of cows feddifferent levels of melamine or after removed the melamine from basaldiet

3.3 泌乳奶牛飼糧三聚氰胺在乳中的沉積規(guī)律

早期反芻動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)研究中三聚氰胺和其類(lèi)似物作為NPN在飼糧中添加，試圖作為氮源，補(bǔ)充瘤胃的氨池，但結(jié)果并不理想［6，18－21］。從奶牛泌乳生理特點(diǎn)而言，牛奶中幾乎所有的成分均由血液通過(guò)血乳屏障供給，加以乳腺泌乳的高效性，乳成分受飼糧因素的調(diào)控及其顯著［7］。在豬和魚(yú)方面的研究中，三聚氰胺在可食組織中僅能微量殘留［24］，而牛奶是奶牛機(jī)體分泌的產(chǎn)物，也是排泄的一種途徑，由本研究結(jié)果可知隨著采食三聚氰胺含量的增加，牛奶中三聚氰胺含量和產(chǎn)量線性增加，3個(gè)劑量組在乳中的轉(zhuǎn)化效率無(wú)顯著差異，其平均值為(0.51±0.10)%，說(shuō)明飼糧三聚氰胺能夠迅速而較為穩(wěn)定地轉(zhuǎn)化至牛奶中。根據(jù)國(guó)家衛(wèi)生部公布的液態(tài)奶中三聚氰胺限量值(2.5 mg/L)，由本試驗(yàn)得出的線性回歸方程推算(圖2)，泌乳奶牛飼糧中三聚氰胺污染含量在455 mg/kg(飼糧干物質(zhì))或在奶牛泌乳水平(13.60±0.21)kg/d條件下，日采食 8 g三聚氰胺時(shí)牛奶中殘留量將達(dá)到限量值(推算值小于本試驗(yàn)中最小劑量，即外推值)。而在 Cruywagen等［6］的研究中，飼糧添加相當(dāng)于17.1 g/d的三聚氰胺時(shí)，其向牛奶的轉(zhuǎn)化率為1.7% ～2.1%，要高于本試驗(yàn)結(jié)果，可能是由于試驗(yàn)?zāi)膛．a(chǎn)奶水平的差異所致，進(jìn)而可說(shuō)明隨奶牛泌乳水平的升高飼糧中三聚氰胺由牛奶排出的比例隨之升高，該結(jié)論還需進(jìn)一步研究證實(shí)。

4 結(jié)論

① 泌乳奶牛飼糧添加三聚氰胺(0.1% ～1.0%)可迅速轉(zhuǎn)化進(jìn)入牛奶，顯著提高牛奶三聚氰胺殘留量。在停止飼喂后乳中三聚氰胺殘留迅速降低，在停喂后的3d內(nèi)殘留基本消失。因此認(rèn)為溶解態(tài)的三聚氰胺可順利通過(guò)血乳屏障，并且三聚氰胺在牛奶中的殘留性敏感，較低含量的飼料污染即可轉(zhuǎn)化至牛奶中。

②奶牛飼糧中隨三聚氰胺添加量的增加乳中尿素含量顯著增加。而飼糧三聚氰胺(0.1% ～1.0%)對(duì)奶牛干物質(zhì)采食量、產(chǎn)奶量和其他乳成分無(wú)影響。

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