飼糧中添加山梨酸對(duì)斷奶仔豬生長(zhǎng)性能、血清生化指標(biāo)及相關(guān)基因mRNA表達(dá)的影響

高 萍 王海峰 方心靈 束 剛 朱曉彤 王松波 王麗娜 江青艷

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，廣州 510642)

仔豬斷奶應(yīng)激是長(zhǎng)期困擾養(yǎng)豬生產(chǎn)的一個(gè)難題。為此，營(yíng)養(yǎng)學(xué)家試圖通過(guò)在斷奶仔豬飼糧中添加外源性物質(zhì)以緩解斷奶應(yīng)激，促進(jìn)仔豬的生長(zhǎng)。近年研究發(fā)現(xiàn)，游離脂肪酸對(duì)預(yù)防和治療代謝綜合征、胰島素抵抗和癌癥有顯著的效果［1］。一些短鏈脂肪酸對(duì)改善腸道環(huán)境、調(diào)節(jié)腸道紊亂、治療和預(yù)防腸道疾病有重要作用［2］。在動(dòng)物生產(chǎn)中，脂肪酸作為功能性飼料添加劑目前研究較多的是共軛亞油酸，它在促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育、降低腹脂沉積和改善肉質(zhì)方面均具有重要的調(diào)節(jié)作用［3-5］。

山梨酸(sorbic acid，SA)，學(xué)名為 2，4- 己二烯酸(CH3CH=CHCH=CHCOOH)，是一種不飽和直鏈脂肪酸。在飼料工業(yè)上，SA作為酸化劑和防霉劑，具有調(diào)節(jié)仔豬胃腸道微生物種群平衡、降低腹瀉率、促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化吸收、抑制飼料霉菌生長(zhǎng)等作用［1］。另外，SA可通過(guò)β氧化的代謝途徑為機(jī)體提供能量，且對(duì)動(dòng)物機(jī)體無(wú)毒副作用［2-3］。鑒于SA具有與共軛亞油酸相似的結(jié)構(gòu)，其是否也具有與共軛亞油酸相似的促進(jìn)仔豬生長(zhǎng)發(fā)育以及調(diào)控脂代謝方面的作用均無(wú)相關(guān)報(bào)道。本試驗(yàn)以純種大約克斷奶仔豬為研究對(duì)象，參照共軛亞油酸和普通酸化劑的使用劑量，在基礎(chǔ)飼糧中添加0.050%、0.125%和0.200%的 SA，研究其對(duì)斷奶仔豬生長(zhǎng)性能、血清生化指標(biāo)及相關(guān)基因mRNA表達(dá)量的影響，旨在為SA在養(yǎng)豬生產(chǎn)中的合理應(yīng)用提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)所用的SA均購(gòu)自寧波王龍科技股份有限公司(食品級(jí)，純度為99.0%)。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)選用28日齡純種大約克斷奶仔豬180頭，按組間體重、性別比例一致的原則，將仔豬分成4組，每組3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)15頭豬(8閹公、7母)。對(duì)照組飼喂基礎(chǔ)飼糧，試驗(yàn)組分別在每千克基礎(chǔ)飼糧中添加 0.500(0.050%SA 組)、1.250(0.125%SA 組)和 2.000 g(0.200%SA 組)的SA。預(yù)試期為7d，35日齡稱仔豬初始重，試驗(yàn)期為42d。

基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))Table 1 Composition and nutrient levels of the basaldiet(air-dry basis) %

1.3 飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)在湖北托佩克種豬有限公司保育舍內(nèi)進(jìn)行，飼養(yǎng)欄舍為封閉、漏縫地板式豬舍。豬只自由采食及飲水，按照常規(guī)免疫程序進(jìn)行免疫接種。

1.4 測(cè)定指標(biāo)及方法

1.4.1 生長(zhǎng)性能測(cè)定

試驗(yàn)仔豬分別于35、56和77日齡稱重(上午，空腹)，計(jì)算各階段及全期平均日增重;試驗(yàn)期記錄喂料量和余料量;計(jì)算各階段及全期平均日采食量和料重比。

1.4.2 血清生化相關(guān)指標(biāo)測(cè)定

在35和77日齡時(shí)，每個(gè)重復(fù)隨機(jī)選取6頭仔豬(閹公和母各占1/2)于前腔靜脈采血10 mL，制備血清，-20℃保存，測(cè)定血清中總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、尿素氮(UN)、總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)含量(由廣州達(dá)安臨床檢驗(yàn)中心測(cè)定)。在77日齡時(shí)，用放射免疫分析法測(cè)定血清中胰島素樣生長(zhǎng)因子-Ⅰ(IGF-Ⅰ)的含量，試劑盒購(gòu)自天津九鼎醫(yī)學(xué)生物工程有限公司。

1.4.3 小腸絨毛形態(tài)測(cè)定

在飼養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)束當(dāng)天，每個(gè)組隨機(jī)選取5頭仔豬(閹割小公豬)進(jìn)行屠宰。取出十二指腸、空腸和回腸組織各2 cm，經(jīng)PBS沖洗后，用10%甲醛溶液固定后制成腸道組織切片，在腸道組織切片上選取5～10個(gè)典型視野(絨毛平整、走向平直)，觀察腸絨毛和隱窩形態(tài)變化，運(yùn)用腸道形態(tài)學(xué)分析軟件測(cè)量腸絨毛高度和隱窩深度，取其平均值作為測(cè)定數(shù)據(jù)。對(duì)絨毛高度和隱窩深度進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，比較絨毛高度、隱窩深度和絨毛高度/隱窩深度的變化。

1.4.4 器官指數(shù)測(cè)定

在飼養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)束當(dāng)天，每個(gè)組隨機(jī)選取5頭仔豬(閹割小公豬)進(jìn)行屠宰。分別對(duì)脾臟、心臟、肝臟和腎臟器官進(jìn)行稱重，計(jì)算器官指數(shù)。

器官指數(shù)(%)=(器官重/體重)×100。

1.4.5 相關(guān)基因表達(dá)量測(cè)定

在飼養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)束當(dāng)天，每個(gè)組隨機(jī)選取5頭仔豬(閹割小公豬)進(jìn)行屠宰。采集背最長(zhǎng)肌和肝臟樣品，置液氮速凍，-80℃保存，采用TRIZOL一步法提取豬背最長(zhǎng)肌和肝臟樣品中的總RNA，總RNA樣品用核酸蛋白測(cè)定儀測(cè)定其濃度及A260/A280，取0.5 μg 總 RNA 進(jìn)行 1%瓊脂糖凝膠電泳，檢測(cè)其完整性。

取2 μg總 RNA立即用隨機(jī)引物和MMLV(Promega公司，USA)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，根據(jù) NCBI中Genbank發(fā)表的基因序列，采用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)豬β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)、IGF-Ⅰ和過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體(PPARs)基因的上、下游引物(表2)。引物由北京奧科生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成。

使用標(biāo)準(zhǔn)SYBR GreenⅠ實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)試劑盒(TaKaRa公司，日本)。20 μL反應(yīng)體系:cDNA 模版(RT 產(chǎn)物)1.0 μL，引物(5 μmol/L)0.8 μL，2 × Real-time PCR Master Mix 10.0 μL，DEPC水補(bǔ)至 20.0 μL。PCR反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性1 min;95 ℃ 15 s，退火30 s，72 ℃ 30 s，40 個(gè)循環(huán)。同時(shí)記錄PCR產(chǎn)物解離曲線，檢驗(yàn)產(chǎn)物的特異性。

以β-actin作為內(nèi)參基因，對(duì)獲得的信號(hào)、數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，根據(jù)以下公式計(jì)算出目的基因相對(duì)于內(nèi)參基因的比值:2-ΔCt=2-(Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因)，反應(yīng)體系置Mx3005P型實(shí)時(shí)定量PCR儀進(jìn)行，數(shù)據(jù)用相對(duì)定量結(jié)果顯示，以對(duì)照組為1。

表2 豬基因引物序列及擴(kuò)增參數(shù)Table 2 Gene primer sequences and amplification parameters of pig

1.5 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，用SAS 9.2統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，生長(zhǎng)性能和血清生化指標(biāo)采用單因素方差分析，并進(jìn)行Tukey多重比較，小腸絨毛形態(tài)和基因表達(dá)采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 飼糧中添加SA對(duì)斷奶仔豬生長(zhǎng)性能的影響

由表3可知，0.200%SA組仔豬體重在56和77日齡時(shí)顯著高于對(duì)照組(P＜0.05);全期平均日增重也顯著高于對(duì)照組(P＜0.05);各組間平均日采食量和料重比無(wú)顯著差異(P＞0.05)。

2.2 飼糧中添加SA對(duì)斷奶仔豬血清生化相關(guān)指標(biāo)的影響

由表4可知，77日齡時(shí)，仔豬血清TP、LDL和IGF-Ⅰ的含量隨SA添加劑量的加大而增加，其中0.200%SA 組顯著高于對(duì)照組(P＜0.05);而且在該日齡，血清 ALB、TG和 HDL的含量是0.125%SA組最高，而血清 UN含量是0.050%SA組最低，其中飼糧中添加0.050%和0.125%的SA和對(duì)照組相比均能顯著提高血清ALB和HDL 的含量(P ＜0.05)。

2.3 飼糧中添加SA對(duì)斷奶仔豬小腸絨毛形態(tài)的影響

由表5可知，十二指腸、空腸和回腸的絨毛高度、隱窩深度和絨毛高度/隱窩深度在0.200%SA組與對(duì)照組之間差異均不顯著(P＞0.05)。

2.4 飼糧中添加SA對(duì)斷奶仔豬器官指數(shù)的影響

由表6可知，與對(duì)照組相比，飼糧中添加0.200%的SA對(duì)斷奶仔豬心臟、脾臟、肝臟以及腎臟指數(shù)無(wú)顯著性影響(P＞0.05)。

表3 飼糧中添加SA對(duì)斷奶仔豬生長(zhǎng)性能的影響Table 3 Effects ofdietary SA on growth performance of weaner piglets

表4 飼糧中添加SA對(duì)斷奶仔豬血清生化指標(biāo)的影響Table 4 Effects ofdietary SA on serum biochemical indexes of weaner piglets

表5 飼糧中添加SA對(duì)斷奶仔豬小腸絨毛形態(tài)的影響Table 5 Effects ofdietary SA on villus morphology of small intestine of weaner piglets

表6 飼糧中添加SA對(duì)斷奶仔豬器官指數(shù)的影響Table 6 Effects ofdietary SA on organ indexes of weaner piglets %

2.5 飼糧中添加SA對(duì)斷奶仔豬組織基因表達(dá)量的影響

由圖1可知，與對(duì)照組相比，0.200%SA能降低肌肉PPARγ的mRNA表達(dá)量(P＜0.05)，具有促進(jìn)肝臟IGF-ⅠmRNA表達(dá)的趨勢(shì)(P=0.058)，但對(duì)肝臟中PPARα及肌肉中IGF-Ⅰ mRNA表達(dá)量無(wú)顯著影響(P＞0.05)。

圖1 飼糧中添加SA對(duì)斷奶仔豬組織IGF-Ⅰ和PPARs mRNA表達(dá)的影響Fig.1 Effects ofdietary SA on IGF-Ⅰ and PPARs mRNA expression of weaner piglets

3 討論

多不飽和脂肪酸不僅是動(dòng)物的必需脂肪酸，而且在維持細(xì)胞膜的完整性、合成體內(nèi)脂肪酸衍生物類激素、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫機(jī)能、穩(wěn)定糖脂代謝水平和改善腸道發(fā)育方面均具有重要的生物學(xué)功能。有研究表明，給斷奶仔豬連續(xù)飼喂7周添加共軛亞油酸的飼糧，仔豬的平均日增重隨共軛亞油酸的添加量增加而呈線性或二次曲線提高［6］。飼糧中添加富含n-3系列多不飽和脂肪酸的魚油和富含n-6系列多不飽和脂肪酸的共軛亞油酸同樣能使斷奶仔豬日增重和飼料轉(zhuǎn)化效率得到明顯提高［6-7］。本研究結(jié)果同樣發(fā)現(xiàn)，在試驗(yàn)各階段飼糧中添加不同劑量的SA均有提高仔豬平均日增重的趨勢(shì)，其中0.200%SA組能顯著提高仔豬平均日增重。而從料重比的結(jié)果分析看，0.125%SA組仔豬對(duì)飼糧的利用效率最高，隨著劑量增加至0.200%反而有所下降。因此，在生產(chǎn)實(shí)踐中SA合理添加劑量可以介于0.125% ～0.200%。上述結(jié)果說(shuō)明SA與其他具有相同共軛結(jié)構(gòu)的直鏈脂肪酸一樣，能調(diào)節(jié)動(dòng)物的生長(zhǎng)發(fā)育。

SA提高仔豬的生長(zhǎng)性能的具體作用機(jī)制還存在爭(zhēng)議。從有機(jī)酸制劑的角度來(lái)看，飼糧中添加酸制劑主要是通過(guò)降低動(dòng)物腸道里消化物pH、改善消化酶的活性、抑制腸道微生物增殖、減少氨氣和生物胺的產(chǎn)量等多種途徑發(fā)揮作用。王杰等［8］研究表明，飼糧中添加0.2%的復(fù)合酸化劑還可以提高斷奶仔豬對(duì)粗蛋白質(zhì)的表觀消化率。另有研究顯示，飼糧中添加0.5%苯甲酸后可以顯著提高斷奶仔豬氮的消化率［9］。Pirgozliev 等［10］研究也發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加SA可以降低氮的內(nèi)源損失，提高氮的表觀代謝能，這可能是由于添加SA提高了蛋白質(zhì)和氨基酸的消化率，進(jìn)而改善動(dòng)物生長(zhǎng)性能。但本研究結(jié)果表明，在77日齡時(shí)，飼糧中添加SA能夠劑量依賴性地提高斷奶仔豬血清TP含量，同時(shí)各組ALB含量也較對(duì)照組有不同程度地提高，而UN含量有降低的趨勢(shì)。該結(jié)果說(shuō)明SA能促進(jìn)正氮平衡，提高營(yíng)養(yǎng)素的利用效率。進(jìn)一步檢測(cè)肝臟和肌肉IGF-Ⅰ基因表達(dá)水平和血清中含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)添加SA均能提高77日齡血清IGF-Ⅰ含量。血液IGF-Ⅰ含量是全身各組織器官分泌IGF-Ⅰ的總體反映，其中以肝臟分泌為主，而肌肉組織亦可表達(dá)IGF-Ⅰ，主要以自分泌方式調(diào)節(jié)肌肉生長(zhǎng)發(fā)育。本研究發(fā)現(xiàn)，飼糧添加SA對(duì)肌肉IGF-Ⅰ mRNA表達(dá)無(wú)顯著影響，但對(duì)肝臟IGF-Ⅰ mRNA表達(dá)具有明顯的促進(jìn)趨勢(shì)。上述結(jié)果提示SA可能通過(guò)促進(jìn)肝臟IGF-Ⅰ的分泌，從而促進(jìn)動(dòng)物的生長(zhǎng)。

血液IGF-Ⅰ含量是反映動(dòng)物機(jī)體生長(zhǎng)發(fā)育的重要激素，既受生長(zhǎng)軸的精細(xì)調(diào)控，同時(shí)又受到各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量的影響。其中脂肪酸，尤其是不飽和長(zhǎng)鏈脂肪酸，可以通過(guò)其內(nèi)源性PPARs直接調(diào)節(jié)肝臟IGF-Ⅰ的分泌。Lecka-czernik等［11］研究顯示，飼糧中添加羅格列酮(PPARγ的人工合成激動(dòng)劑)能夠顯著影響大鼠血清IGF-Ⅰ的含量，并且證實(shí)是通過(guò)PPARγ途徑介導(dǎo)的。本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)，肝臟PPARα的活性對(duì)IGF-Ⅰ分泌也有調(diào)節(jié)作用，其中 GW7647(PPARα激動(dòng)劑)促進(jìn)IGF-Ⅰ分泌，而GW9622(PPARγ阻斷劑)則抑制其分泌［12］。本研究結(jié)果表明，飼糧中添加0.200%SA有上調(diào)肝臟IGF-Ⅰ mRNA表達(dá)的趨勢(shì)，而對(duì)肌肉中IGF-Ⅰ mRNA表達(dá)豐度則無(wú)顯著影響，提示SA的促IGF-Ⅰ分泌作用很可能與肝臟PPARs系統(tǒng)有關(guān)。通常PPARs配體在激活或阻斷PPARs以外，還能夠調(diào)節(jié)該受體的基因表達(dá)水平。Kang等［13］研究發(fā)現(xiàn)順-10，反-12共軛亞油酸能抑制脂肪組織PPARγ的表達(dá)水平，從而降低小鼠脂肪沉積。本文研究結(jié)果也發(fā)現(xiàn)，SA也可以顯著降低肌肉組織PPARγ mRNA的表達(dá)水平，提示SA可能在減少脂肪沉積，改善胴體品質(zhì)方面同樣具有重要的應(yīng)用潛能。

另一方面，由于飼糧形態(tài)、飼糧抗原及仔豬本身營(yíng)養(yǎng)供給的不足，仔豬斷奶過(guò)程中腸道形態(tài)和結(jié)構(gòu)往往發(fā)生絨毛萎縮、隱窩加深等退行性變化。有研究表明，某些脂肪酸也可以通過(guò)促進(jìn)胃腸道發(fā)育，改善腸道健康，從而提高仔豬生長(zhǎng)性能。Bosi等［14］研究表明，飼糧中添加包被的甲酸鈣顯著提高了仔豬小腸絨毛高度和平均日增重。Jurkowska等［15］報(bào)道，飼糧中添加短鏈脂肪酸可以顯著增加遠(yuǎn)段空腸及回腸的隱窩深度、絨毛高度和黏膜厚度，顯著降低十二指腸的黏膜厚度。Claus等［16］研究發(fā)現(xiàn)，在飼糧中添加包被的丁酸鹽可增加豬空腸中段皺襞面積。晏家友等［17］研究也表明，二元雜交(大×長(zhǎng))仔豬飼糧中添加以延胡索酸、乳酸、檸檬酸和蘋果酸為主要成分的復(fù)合酸化劑，極顯著降低試驗(yàn)第5周時(shí)仔豬的空腸隱窩深度和提高絨毛高度/隱窩深度。但本研究結(jié)果并未發(fā)現(xiàn)飼糧中添加0.200%SA對(duì)仔豬各腸段的隱窩深度和絨毛高度/隱窩深度有顯著影響，說(shuō)明SA對(duì)斷奶仔豬的促生長(zhǎng)作用可能并非通過(guò)促進(jìn)腸道發(fā)育而實(shí)現(xiàn)。

4 結(jié)論

①飼糧中添加SA有劑量依賴性提高斷奶仔豬的體重和平均日增重的趨勢(shì)，其中以0.125% ～0.200%劑量的效果較好。

②在本試驗(yàn)條件下，飼糧中添加適宜的SA可提高仔豬血清 TP、LDL、ALB、HDL 和 IGF-Ⅰ的含量，但對(duì)小腸黏膜形態(tài)以及脾臟、心臟、肝臟、腎臟器官指數(shù)均無(wú)顯著影響。

③飼糧中添加0.200%SA能夠促進(jìn)斷奶仔豬生長(zhǎng)，其作用可能是通過(guò)PPARs系統(tǒng)提高血清IGF-Ⅰ的含量而實(shí)現(xiàn)的。

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