仿生化提取人參皂苷類成分的初步研究Δ

陳新，胡朝奇，張洪長，孫艷（.長春中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，長春07；.長春中醫(yī)藥大學(xué)研發(fā)中心，長春 07；.通化萬通藥業(yè)股份有限公司，吉林通化 4000）

人參為五加科植物人參Panax ginsengC.A.Meyer.的干燥根與根莖，人參皂苷為其主要成分之一。傳統(tǒng)溶劑提取法以水、乙醇作為溶劑，采用煎煮法、滲漉法、回流提取等方法進(jìn)行提取，近年來許多新的提取技術(shù)用于人參皂苷，如超聲提取法、微波提取法、超臨界二氧化碳提取法與超高壓提取法等[1，2]。上述提取方法的原理主要基于化學(xué)浸提的“相似者相溶”原則。提取溶劑、條件與人體消化系統(tǒng)的生理條件有很大差別，因此得到的有效成分或部位存在體外有效，但進(jìn)入體內(nèi)卻無效的現(xiàn)象，而有些在體外無效的成分卻被作為雜質(zhì)棄去或根本沒有從中藥中提取出來，但這些成分可能在體內(nèi)胃腸液作用下發(fā)生轉(zhuǎn)化或代謝，而其轉(zhuǎn)化的成分或代謝產(chǎn)物則具有良好活性，且易于被吸收入血發(fā)揮作用，因此傳統(tǒng)方法篩選有效成分的效率較低，且浪費巨大?；诳诜幬锏捏w內(nèi)運轉(zhuǎn)過程，筆者提出仿生化提取構(gòu)想，即建立一種與人體胃腸生理學(xué)環(huán)境相接近的胃腸道模擬法，提取條件較化學(xué)浸提法更接近人體真實的胃腸生理條件，提取溶劑依據(jù)胃液和腸液的組成，人工制備成系列提取溶媒，提取溫度在37℃，攪拌動態(tài)提取。在國外，胃腸系統(tǒng)的體外模擬試驗已成為一種非常有效的評估污染物方法，目前國際上已有十余種胃腸模擬方法[3]。本研究以人參超微粉為原料，分別以仿生溶媒和水為提取溶劑，以人參總皂苷、人參皂苷Rg1和人參皂苷Re含量之和為考察指標(biāo)，比較2種提取法的提取率，為仿生化提取中藥化學(xué)成分可行性提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試藥

LC-10AT高效液相色譜（HPLC）儀，包括SPD-10Av檢測器（日本島津公司）；Spectrumlab752S紫外-可見分光光度計（上海棱光技術(shù)有限公司）；ZF-6三用紫外分析儀（上海嘉鵬科技有限公司）；BMF-6超微粉碎機（濟南倍力粉工程有限公司）；飛鴿LXJ-ⅡB低速大容量多管離心機（上海安亭科學(xué)儀器廠）；DZKW-4電子恒溫水浴鍋（北京中興偉業(yè)儀器有限公司）；KQ-250B超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，功率：250W，頻率：40kHz）；7321電動攪拌機調(diào)速器（上海標(biāo)本模型廠）。

人參采于吉林省撫松市，經(jīng)長春中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定室鑒定為真品。人參皂苷Re（批號：110754-200822）、人參皂苷Rg1（批號：110703-200221）對照品購于中國食品藥品檢定研究院；胃蛋白酶（1∶3000，上海源葉生物科技有限公司）；乙腈（色譜純，美國Fisher公司）；水為蒸餾水，其他試劑均為分析純。

2 方法

2.1 提取方法

2.1.1 仿生化提取方法 取人參超微粉（藥材60℃真空干燥，超微粉碎，過300目篩）適量，精密稱定，加入仿生溶媒（0.2%氯化鈉、0.32%胃蛋白酶、0.7%鹽酸加水配制成100mL溶液）25倍，置37℃水浴中，攪拌，提取1h，離心，上清液用水飽和正丁醇振搖提取3次，合并正丁醇液，減壓回收，低溫真空干燥，得人參仿生化提取物。

2.1.2 水提取方法 取人參超微粉適量，精密稱定，加入水25倍，置37℃水浴中，攪拌，提取1h，離心，上清液用水飽和正丁醇振搖提取3次，合并正丁醇液，減壓回收，低溫真空干燥，得人參水提取物。

2.2 人參總皂苷含量測定方法

2.2.1 對照品溶液的制備 取人參皂苷Re對照品適量，精密稱定，用甲醇定容于100mL容量瓶中，制成濃度為0.2mg·mL－1的人參皂苷Re對照品溶液。

2.2.2 檢測波長的選擇 精密吸取對照品溶液1.0mL，置具塞試管中，將試管置于冰水浴中，再加入0.5mL 8%香草醛乙醇溶液和77%硫酸5mL，搖勻，混合物置60℃恒溫水浴中加熱10min后，立即在冰水浴中冷卻15min；并在另一試管中加甲醇1.0mL，加隨行試劑，作空白對照，在400～760nm波長范圍內(nèi)測定人參皂苷Re的吸光度。結(jié)果，人參皂苷Re在544nm波長處有最大吸收，故選擇544nm為檢測波長。

2.2.3 線性關(guān)系的考察[4]精密吸取人參皂苷Re對照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL，分別置于具塞試管中，將試管置于冰水浴中，分別加入0.8、0.6、0.4、0.2、0mL甲醇后，再加入8%香草醛乙醇溶液0.5mL和77%硫酸5mL，搖勻，混合物置60℃恒溫水浴中加熱10min后，立即在冰水浴中冷卻15min，每個樣品做3個平行樣，并在另一試管中加甲醇1.0mL，加隨行試劑，作空白對照，在544nm波長處測吸光度。以人參皂苷Re進(jìn)樣量（X，mg·mL－1）為橫坐標(biāo)，吸光度（Y）為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為Y＝3.3318X+0.0284（r＝0.9996）。結(jié)果表明，人參皂苷Re進(jìn)樣量在0.044～0.220mg范圍內(nèi)與吸光度呈良好線性關(guān)系。

2.3 人參皂苷Rg1和人參皂苷Re含量測定方法[5]

2.3.1 色譜條件色譜柱：Zorbax XDB-C18（250mm×4.6mm，5μm）；填充劑：十八烷基硅烷鍵合硅膠；流動相：乙腈-0.05%磷酸溶液（20∶80）；流速：1.0mL·min－1；檢測波長：203nm；柱溫：室溫；進(jìn)樣量：10μL。理論板數(shù)按人參皂苷Rg1峰計算應(yīng)不低于6000。

2.3.2 混合對照品溶液制備 分別精密稱取人參皂苷Rg1對照品、人參皂苷Re對照品適量，加甲醇制成每1mL分別含人參皂苷Rg10.24mg、人參皂苷Re0.36mg的混合對照品溶液，搖勻，即得。

2.3.3 線性關(guān)系考察 分別精密吸取2、5、10、15、20μL混合對照品溶液，注入液相色譜儀，記錄峰面積積分值。分別以人參皂苷Rg1、人參皂苷Re進(jìn)樣量（X，μg）為橫坐標(biāo)，峰面積積分值（Y）為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得人參皂苷Rg1、人參皂苷Re的回歸方程分別為Y＝1323.7X－15395（r＝0.9998）、Y＝1659.4X+5200.8（r＝0.9999）。結(jié)果表明，人參皂苷Rg1、人參皂苷Re進(jìn)樣量分別在0.48～4.80、0.72～7.20μg范圍內(nèi)與峰面積積分值呈良好線性關(guān)系。

3 結(jié)果

3.1 不同提取方法下人參總皂苷提取率的比較

分別取人參仿生化提取物與水提取物適量，精密稱定，加甲醇制備成0.5mg·mL－1的供試品溶液。按“2.2”項下方法測定，并根據(jù)回歸方程計算總皂苷含量，照下式計算總皂苷提取率：提取率＝提取物中總皂苷含量/藥材中總皂苷含量×100%。結(jié)果，人參超微粉經(jīng)仿生化提取后，總皂苷提取率較水提取法高出13%，詳見表1。

表1 不同提取方法下人參總皂苷提取率的比較（n＝3）Tab 1 Comparison of extraction rate of TSPG bydifferent extraction methods（n＝3）

3.2 不同提取方法下人參皂苷Rg1和人參皂苷Re總提取率的比較

分別取人參皂苷仿生化提取物和水提取物適量，精密稱定，加甲醇制備成每1mg·mL－1的溶液，搖勻，經(jīng)微孔濾膜（0.45μm）濾過，作為供試品溶液。分別精密吸取2種供試品溶液10μL，注入液相色譜儀，按“2.3”項下方法測定，外標(biāo)一點法計算含量，并按下式計算提取率：提取率＝提取物中人參皂苷Rg1與人參皂苷Re含量之和/藥材中人參皂苷Rg1與人參皂苷Re含量之和×100%。結(jié)果，人參超微粉經(jīng)仿生化提取后，人參皂苷Rg1，與人參皂苷Re提取率較水提取法高出45%。色譜見圖1；提取率測定結(jié)果見表2。

圖1 高效液相色譜圖A.人參皂苷Re和人參皂苷Rg1混合對照品；B.仿生提取物；C.水提取物Fig 1 HPLC chromatogramsA.mixed control of ginsenoside Rg1and Re；B.biomimetic extract；C.water extract

表2 不同提取方法下人參皂苷Rg1與人參皂苷Re含量之和及其提取率測定結(jié)果（n＝3）Tab 1 Results of the content and extraction rate of the sum of ginsenoside Re and Rg1by different extraction methods（n＝3）

4 討論

決定中藥中的一個、一種或一組化學(xué)物質(zhì)是否為有效化學(xué)成分、有效效應(yīng)物質(zhì)，由它或它們在體內(nèi)的行為來確定，其在胃腸內(nèi)和肝內(nèi)的行為尤為重要，這已成為中藥實驗醫(yī)學(xué)中的關(guān)鍵性基礎(chǔ)科學(xué)問題[6]。Odani T等[7]發(fā)現(xiàn)，人參皂苷Rg1的口服生物利用度僅為1.9%～20%。但人參皂苷Rg1可在胃液作用下水解掉一分子葡萄糖生成代謝產(chǎn)物人參皂苷Rh1和人參皂苷F1，而且其代謝產(chǎn)物在血液中濃度較高，這可能是人參皂苷Rg1發(fā)揮益智和抗衰老作用的主要活性成分[8]。仿生化提取法得到的提取物HPLC圖顯示，在人參皂苷Rg1和人參皂苷Re色譜峰前后分別出現(xiàn)新的色譜峰，提示在該提取條件下可能有成分轉(zhuǎn)化或有未被水提取出來的成分，對該成分的確定有待進(jìn)一步研究。

基于動態(tài)模擬人體生理機能的仿生化提取法，本研究主要進(jìn)行體外模擬胃生理環(huán)境條件下對人參皂苷類成分進(jìn)行提取，仿生化提取結(jié)果取決于以下幾個因素：（1）提取溶媒，它是該方法的核心。不同于傳統(tǒng)的提取溶劑，仿生提取溶媒由酶、酸、堿和無機鹽等組成，可按照不同組成和比例配制成系列仿生提取溶媒。胃在不同狀態(tài)下pH值不同，如在空腹?fàn)顟B(tài)下pH值一般為1.5左右，飽腹?fàn)顟B(tài)下為4.0左右。而pH值對成分的溶解析出影響很大，仿生提取溶媒可調(diào)成不同pH值進(jìn)行提取。（2）溫度。雖然增加溫度能使擴散系數(shù)加大，擴散速度增加，但人體溫度為37℃，故本研究在該溫度下進(jìn)行提取。國外的十幾種體外胃腸模擬試驗溫度均確定在37℃[5]。（3）提取方式。依據(jù)人體消化過程，一方面人體胃是不斷蠕動消化的，在消化和吸收過程中是動態(tài)過程；另一方面，根據(jù)提取擴散公式[9]G＝D×F（c1－c2）t/δ，濃度差（c1－c2）對提取率有明顯影響，因此選擇攪拌提取。

基于人參皂苷Re在人參藥材中含量較高，文獻(xiàn)報道[10]對人參藥材中總皂苷含量測定亦是選擇該成分作為對照，以此標(biāo)示人參藥材中總皂苷含量。故筆者以人參皂苷Re作為人參總皂苷含量測定的標(biāo)示物。

綜上所述，筆者選擇模擬胃生理條件提取人參總皂苷，經(jīng)仿生化提取的人參皂苷類成分應(yīng)更易于被人體吸收，從而具有良好的生物利用度。后期研究一方面要進(jìn)一步考察如壓力或無氧條件對化學(xué)成分提取的影響；另一方面將通過動物實驗，證明仿生化提取物的安全性和有效性。

[1] 張 晶，陳全成，弓曉杰，等.不同提取方法對人參皂苷提取率的影響[J].吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2003，25（1）：71.

[2] 陳瑞戰(zhàn)，張守琴，王長征.常溫超高壓提取人參總皂苷[J].化工學(xué)報，2005，56（5）：911.

[3] 張東平，余應(yīng)新，張 帆，等.環(huán)境污染物對人體生物有效性測定的胃腸模擬研究現(xiàn)狀[J].科學(xué)通報，2008，53（21）：2537.

[4] 王利勝，袁愛賢，韓 堅，等.HPLC法測定川芎嗪在小鼠血漿、腦、肝中的含量[J].中國藥房，2008，19（9）：654.

[5] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（一部）[S].2010年版.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：8.

[6] 楊秀偉.中藥實驗醫(yī)學(xué)中的關(guān)鍵基礎(chǔ)科學(xué)問題[J].中西醫(yī)結(jié)合學(xué)報，2005，3（2）：154.

[7] Odani T，Tanizawa H，Takino Y.Studies on the absorption，distribution，excretion and metabolism of ginseng saponinsⅡ.The absorption，distribution and excretion of ginsenoside rglin the rat.[J].Chem Pharm Bull（Tokyo），1983，31（1）：292.

[8] 馮 亮，胡昌江，余凌英.人參皂苷Rg1及其代謝產(chǎn)物的藥代動力學(xué)研究[J].藥學(xué)學(xué)報，2010，45（5）：636.

[9] 屠錫德，張鈞壽，朱家璧.藥劑學(xué)[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，1985：634.

[10] 陳發(fā)奎.常用中草藥含量測定[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，1997：11-13.