因?qū)幤募毙院吐远拘詫?shí)驗(yàn)研究Δ

周濤，李國熊，茹麗，侯連兵（1.南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院藥學(xué)部，廣州510515；.重慶市中山醫(yī)院，重慶 40001；.廣州中醫(yī)藥大學(xué)科技產(chǎn)業(yè)園，廣州 510445）

因?qū)幤瑸槟戏结t(yī)院院內(nèi)制劑，是由昆明山海棠、黃芪、當(dāng)歸等9味中藥組成的復(fù)方制劑，適應(yīng)證為甲狀腺功能亢進(jìn)（甲亢）。臨床前研究與臨床應(yīng)用均表明因?qū)幤瑢卓壕哂辛己玫母纳谱饔肹1，2]。其中昆明山海棠具有抗炎、免疫抑制的作用[3]，黃芪具有增強(qiáng)免疫功能、增強(qiáng)機(jī)體耐缺氧與抗應(yīng)激能力等作用[4]。為了進(jìn)一步評價(jià)因?qū)幤陌踩?，筆者進(jìn)行了急性和慢性毒性實(shí)驗(yàn)，為臨床安全用藥提供依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

PocH-100iV Diff型全自動動物血液分析儀（日本Sysmex公司）；7080型全自動生化分析儀（日本日立公司）；DMRA自動旋轉(zhuǎn)熒光顯微鏡（德國Leica公司）。

1.2 試藥

因?qū)幤戏结t(yī)院藥學(xué)部制劑中心，批號：20110618，0.3g/片，1g相當(dāng)于3.38g中藥材）；蒸餾水（新南方藥物安全性評價(jià)中心）。

1.3 動物

SPF級KM小鼠40只，♀♂兼半，體重18～22g；SPF級SD大鼠48只，♀♂兼半，體重140～160g，均由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供（動物使用許可證號：SYXK（粵）2008-0014）。

2 方法

2.1 因?qū)幤瑢π∈蟮募毙远拘詫?shí)驗(yàn)

通過預(yù)實(shí)驗(yàn)，未測出半數(shù)致死量（LD50），轉(zhuǎn)而測定最大耐受量（MTD）。將40只小鼠，按預(yù)編號與體重分層數(shù)字隨機(jī)分為2組，即空白對照（等容生理鹽水）、因?qū)幤?2g·kg－1）組，24h內(nèi)2次ig給藥（間隔6h）。給藥間隔期間連續(xù)觀察小鼠的反應(yīng)，給藥結(jié)束后每天上、下午各觀察1次，連續(xù)14d，每天記錄小鼠的一般狀況，包括外觀、行為、分泌物、排泄物、死亡情況與中毒反應(yīng)（中毒反應(yīng)的癥狀、嚴(yán)重程度、起始時間、持續(xù)時間、是否可逆）等，并記錄體重和攝食量，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后大體解剖小鼠，肉眼觀察各臟器的病變情況。

2.2 因?qū)幤瑢Υ笫蟮穆远拘詫?shí)驗(yàn)

將48只大鼠隨機(jī)分為4組，即空白對照（等容生理鹽水）與因?qū)幤摺⒅?、低劑量?、3、0.6g·kg－1，相當(dāng)于臨床人日劑量的100、10、5倍）組。ig給藥，每天1次，連續(xù)30d，給藥期間大鼠自由攝食和飲水。每天觀察記錄大鼠的一般狀況如進(jìn)食、行為活動、糞便等。每周稱體重，記錄攝食量，并根據(jù)體重變化及時調(diào)整用藥劑量。末次給藥24h后，ip3%戊巴比妥鈉溶液麻醉大鼠，腹主動脈采血，采集的血樣于血液分析儀上檢測紅細(xì)胞（RBC）、中性粒細(xì)胞（NE）、嗜酸性粒細(xì)胞（EO）、嗜堿性粒細(xì)胞（BA）、網(wǎng)織RBC、單核巨噬細(xì)胞（MO）、血紅蛋白（HGB）、RBC壓積（HCT）、平均RBC體積（MCV）、平均RBC血紅蛋白量（MCH）、平均血紅蛋白濃度（MCHC）、血小板（PLT）、淋巴細(xì)胞（LY）等血液學(xué)指標(biāo)。另取血分離血清，于自動生化分析儀上測定血液生化指標(biāo)（谷丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、肌酐（Cre）、血糖（GLU）、尿素氮（URE）、總膽紅素（BIL）、血清鈣（Ca）、堿性磷酸酶（ALP）、膽固醇（CHO）、血清總蛋白（TP）、血清白蛋白（ALB）、磷酸肌酸激酶（CK）、乳酸脫氫酶（LDH）、甘油三酯（TG）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、血清鈉（Na）、血清鉀（K）、血清氯（Cl））。對主要臟器進(jìn)行全面尸檢，取腦、心、肝、脾、肺、腎等臟器稱重，計(jì)算臟器系數(shù)（臟器/體重）。主要臟器用10%甲醛固定，進(jìn)行常規(guī)病理學(xué)檢查。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 對小鼠的急性毒性實(shí)驗(yàn)

3.1.1 因?qū)幤瑢π∈笠话銧顩r的影響和MTD的測定 給藥間隔期間和14d觀察期內(nèi)，各組小鼠精神和自主行為活動狀況良好、皮膚被毛清潔、大小便正常，亦未見其它毒性反應(yīng)癥狀。根據(jù)因?qū)幤鞈乙旱淖畲鬂舛龋?.4g·mL－1）和小鼠的最大ig體積（40mL·kg－1），得出MTD為32g·kg－1，相當(dāng)于臨床人日劑量（0.06g·kg－1）的534倍。

3.1.2 因?qū)幤瑢π∈篌w重變化的影響 小鼠體重增長正常，各個時期因?qū)幤M與空白對照組比較，體重?zé)o顯著性差異（P＞0.165），提示因?qū)幤瑢π∈蟮捏w重變化無影響。因?qū)幤瑢π∈篌w重變化的影響見表1。

表1 因?qū)幤瑢π∈篌w重變化的影響（±s）Tab 1 Effects of Yinning tablets on the variation of body weight in mice（±s）

表1 因?qū)幤瑢π∈篌w重變化的影響（±s）Tab 1 Effects of Yinning tablets on the variation of body weight in mice（±s）

劑量/g·kg－1n 體重/g 組別空白對照組因?qū)幤M-322020給藥前19.55±1.8219.13±1.30第1d 22.21±1.7022.80±1.30第2d 26.91±3.3127.97±2.64第7d 29.68±3.3130.88±4.51第14d 32.97±5.4934.65±6.80

3.1.3 因?qū)幤瑢π∈髷z食量的影響 因?qū)幤M與空白對照組比較，小鼠的攝食量無顯著性差異（P＞0.337），提示因?qū)幤瑢π∈蟮臄z食量無影響。因?qū)幤瑢π∈髷z食量的影響見表2。

表2 因?qū)幤瑢π∈髷z食量的影響（±s）Tab 2Effects of Yinning tablets on food intake in mice（±s）

表2 因?qū)幤瑢π∈髷z食量的影響（±s）Tab 2Effects of Yinning tablets on food intake in mice（±s）

劑量/g·kg－1n 攝食量（g·10g－1）組別空白對照組因?qū)幤M-322020第3d 2.48±0.252.33±0.15第6d 2.06±0.202.01±0.16第13d 1.83±0.151.83±0.03

3.1.4 因?qū)幤瑢π∈蟾髋K器的影響 給藥結(jié)束后第14d大體解剖小鼠，肉眼觀察各臟器，心、肝、脾、肺、腎等均無異常。

3.2 對大鼠的慢性毒性實(shí)驗(yàn)

3.2.1 因?qū)幤瑢Υ笫笠话銧顩r的影響 給藥期間，因?qū)幤?、中、低劑量組大鼠的外觀體征、行為活動、進(jìn)食量與糞便等狀況均正常，大鼠無一死亡。

3.2.2 因?qū)幤瑢Υ笫篌w重變化的影響 大鼠體重增長正常，與空白對照組比較，各個時期因?qū)幤摺⒅?、低劑量組體重?zé)o顯著性差異（P＞0.783），提示因?qū)幤瑢Υ笫蟮捏w重變化無影響。因?qū)幤瑢Υ笫篌w重變化的影響見表3。

表3 因?qū)幤瑢Υ笫篌w重變化的影響（±s）Tab 3 Effects of Yinning tablets on the variation of body weight in rats（±s）

表3 因?qū)幤瑢Υ笫篌w重變化的影響（±s）Tab 3 Effects of Yinning tablets on the variation of body weight in rats（±s）

組別空白對照組因?qū)幤蛣┝拷M因?qū)幤袆┝拷M因?qū)幤邉┝拷M劑量/g·kg－1n體重/g-0.63 612121212給藥前226.69±28.22223.33±27.65223.12±28.80225.23±26.11第7d 271.81±48.93266.63±46.55268.24±47.66275.41±44.14第14d 311.25±65.20300.47±61.40313.73±61.67298.29±55.65第21d 343.84±74.95324.78±72.80345.43±74.50323.14±66.44第28d 369.50±91.30352.99±85.33374.91±86.39342.48±76.54

3.2.3 因?qū)幤瑢Υ笫髷z食量變化的影響 大鼠攝食量正常，與空白對照組比較，各個時期因?qū)幤?、中、低劑量組攝食量無顯著性差異（P＞0.221），提示因?qū)幤瑢Υ笫蟮臄z食量無影響。因?qū)幤瑢Υ笫髷z食量的影響見表4。

3.2.4 因?qū)幤瑢Υ笫笱簩W(xué)指標(biāo)的影響 與空白對照組比較，因?qū)幤蛣┝拷MRBC、HGB、HCT、LY數(shù)顯著升高（P＜0.01），PLT、NE、EO數(shù)顯著降低（P＜0.01）；因?qū)幤袆┝拷MNE、網(wǎng)織RBC數(shù)、EO數(shù)顯著降低（P＜0.01或P＜0.05），LY、MO數(shù)顯著升高（P＜0.01或P＜0.05）；因?qū)幤邉┝拷M大鼠的LY數(shù)顯著升高（P＜0.05），EO數(shù)顯著降低（P＜0.01）。因?qū)幤瑢Υ笫笱簩W(xué)指標(biāo)的影響見表5。

表4 因?qū)幤瑢Υ笫髷z食量的影響（±s）Tab 4 Effects of Yinning tablets on food intake in rats（±s）

劑量/g·kg－1n 攝食量（g·10g－1）組別空白對照組因?qū)幤蛣┝拷M因?qū)幤袆┝拷M因?qū)幤邉┝拷M-0.63 612121212第7d 9.51±0.649.00±0.299.43±0.408.98±0.30第14d 8.08±0.668.03±0.138.15±0.518.10±0.32第21d 8.40±0.657.73±0.538.18±0.318.38±0.82第28d 7.78±0.687.53±0.507.33±0.337.75±0.17

表5 因?qū)幤瑢Υ笫笱簩W(xué)指標(biāo)的影響（±s）Tab 5 Effects of Yinning tablets on hematology index in rats（±s）

表5 因?qū)幤瑢Υ笫笱簩W(xué)指標(biāo)的影響（±s）Tab 5 Effects of Yinning tablets on hematology index in rats（±s）

與空白對照組比較：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01vs.blank control group：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

檢測項(xiàng)目WBC/×103·μL－1 RBC/×106·μL－1 HGB/g·dL－1 HCT/%MCV/fL MCH/pg MCHC/g·dL－1 PLT/×103·μL－1 NE/%LY/%EO/%MO/%BA/%網(wǎng)織紅細(xì)胞/%因?qū)幤邉┝拷M4.98±1.127.90±0.6615.67±1.0745.03±3.2457.08±2.0719.85±0.9234.81±0.541334.42±136.1214.58±3.4582.58±3.80＊1.16±1.03＊＊1.67±0.490.00±0.000.81±0.14空白對照組4.84±1.058.20±0.5916.07±1.1745.96±3.3456.08±1.2019.60±0.4734.97±0.271393.58±123.5016.42±2.7179.75±3.252.33±0.891.50±0.520.00±0.000.83±0.15因?qū)幤蛣┝拷M4.78±1.419.67±1.41＊＊19.03±2.60＊＊54.63±7.43＊＊56.62±1.8119.73±0.8934.85±0.611173.75±230.18＊＊12.58±3.26＊＊84.83±3.51＊＊1.17±0.72＊＊1.42±0.790.00±0.000.76±0.09因?qū)幤袆┝拷M5.88±1.568.34±0.4416.20±0.7146.68±2.5655.98±1.4119.41±0.6134.70±0.291434.55±152.0913.18±1.47＊83.45±1.81＊＊1.18±0.60＊＊2.09±0.83＊0.00±0.000.70±0.08＊

3.2.5 因?qū)幤瑢Υ笫笱荷笜?biāo)的影響 與空白對照組比較，因?qū)幤蛣┝拷MTG含量顯著降低（P＜0.05）；因?qū)幤袆┝拷MGLU含量顯著降低（P＜0.01），Na顯著升高（P＜0.05）；因?qū)幤邉┝拷MTP、ALb、TG含量顯著降低（P＜0.01或P＜0.05）。因?qū)幤瑢Υ笫笱荷笜?biāo)的影響見表6。

表6 因?qū)幤瑢Υ笫笱荷笜?biāo)的影響（±s）Tab 6Effects of Yinning tablets on blood biochemical index in rats（±s）

表6 因?qū)幤瑢Υ笫笱荷笜?biāo)的影響（±s）Tab 6Effects of Yinning tablets on blood biochemical index in rats（±s）

與空白對照組比較：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01vs.blank control group：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

檢測項(xiàng)目ALT/U·L－1 Cre/μmol·L－1 GLU/mmol·L－1 URE/mmol·L－1 BIL/μmol·L－1 Ca/mmol·L－1 ALP/U·L－1 CHO/mmol·L－1 TP/g·L－1 ALb/g·L－1 CK/U·L－1 LDH/U·L－1 TG/mmol·L－1 AST/U·L－1 Na/mmol·L－1 K/mmol·L－1 Cl/mmol·L－1因?qū)幤邉┝拷M26.82±5.3727.11±4.136.25±0.516.68±0.880.68±0.322.30±0.06127.69±42.271.42±0.3252.45±2.14＊34.43±1.74＊＊399.18±89.80683.38±182.370.36±0.12＊＊101.14±15.12143.50±0.843.98±0.31106.03±1.74空白對照組24.71±5.5828.88±4.746.56±0.637.23±1.020.74±0.272.35±0.06135.81±41.811.39±0.2754.96±2.8436.43±2.03422.55±98.58898.17±301.380.64±0.31111.69±25.78143.16±1.324.18±0.25105.90±2.34因?qū)幤蛣┝拷M21.20±4.5430.78±4.976.62±0.567.95±1.180.68±0.292.41±0.11129.43±34.481.31±0.2354.64±2.6536.25±1.86421.73±108.16791.88±206.800.45±0.15＊95.48±11.87144.05±0.984.15±0.24107.02±1.26因?qū)幤袆┝拷M25.94±6.7030.09±6.605.61±0.50＊＊7.26±1.330.82±0.192.32±0.05123.50±29.321.33±0.2553.76±1.7135.68±1.41469.58±129.181060.44±368.740.49±0.24122.03±28.60144.36±1.38＊4.10±0.27105.78±2.07

3.2.6 因?qū)幤瑢Υ笫蟾髋K器的影響 因?qū)幤?、中、低劑量組大鼠的各臟器系數(shù)與空白對照組比較，均無顯著性差異（P＞0.05）。因?qū)幤瑢Υ笫蟾髋K器系數(shù)的影響見表7。

3.2.7 因?qū)幤瑢Υ笫蠼M織器官的影響 末次給藥24h后，處死各組大鼠，肉眼觀察心、肝、脾、肺、腎、胃等臟器外形、體積、色澤均屬正常，無充血、腫脹、壞死等異常現(xiàn)象。各臟器用10%甲醛固定48h后，按常規(guī)法做病理切片，光鏡下觀察。結(jié)果，因?qū)幤摺⒅?、低劑量組大鼠的心、肝、脾、肺、腎等臟器與空白對照組比較，均未見異常。病理組織學(xué)檢查未見到由于因?qū)幤拘砸鸬牟±砀淖?。臟器病理切片見圖1。

表7 因?qū)幤瑢Υ笫蟾髋K器系數(shù)的影響（±s）Tab 7 Effects of Yinning tablets on organ coefficient in rats（±s）

表7 因?qū)幤瑢Υ笫蟾髋K器系數(shù)的影響（±s）Tab 7 Effects of Yinning tablets on organ coefficient in rats（±s）

n臟器腦胸腺心臟肝臟脾臟肺臟腎臟腎上腺睪丸附睪卵巢子宮12121212121212126 6 6 6空白對照組0.64±0.140.15±0.040.32±0.032.89±0.150.21±0.030.43±0.061.23±0.660.02±0.010.85±0.060.26±0.030.06±0.010.23±0.03因?qū)幤蛣┝拷M0.66±0.150.15±0.050.32±0.032.79±0.180.20±0.020.47±0.081.09±0.490.02±0.010.80±0.160.24±0.020.05±0.010.17±0.08因?qū)幤袆┝拷M0.63±0.130.15±0.040.31±0.022.90±0.170.21±0.020.44±0.091.17±0.470.02±0.010.86±0.070.27±0.030.06±0.010.25±0.05因?qū)幤邉┝拷M0.67±0.130.14±0.030.31±0.022.89±0.180.21±0.020.45±0.061.21±0.510.02±0.010.93±0.080.27±0.020.06±0.010.22±0.06

圖1 臟器病理切片A1.空白對照組心臟；A2.因?qū)幤邉┝拷M心臟；B1.空白對照組肝臟；B2.因?qū)幤邉┝拷M肝臟；C1.空白對照組脾臟；C2.因?qū)幤邉┝拷M脾臟；D1.空白對照組肺；D2.因?qū)幤邉┝拷M肺；E1.空白對照組腎臟；E2.因?qū)幤邉┝拷M腎臟；F1.空白對照組胃；F2.因?qū)幤邉┝拷M胃Fig 1 Pathological section of several organsA1.blank control group heart；A2.Yinning tablet high dose group heart；B1.blank control group liver；B2.Yinning tablet high dose group liver；C1.blank control group spleen；C2.Yinning tablet high dose group spleen；D1.blank control group lung；D2.Yinning tablet high dose group lung；E1.blank control group kidney；E2.Yinning tablet high dose group kidney；F1.blank control group stomach；F2.Yinning tablet high dose group stomach

4 討論

甲亢是由多種原因引起甲狀腺激素過多導(dǎo)致機(jī)體代謝過高的內(nèi)分泌疾病。甲亢可以影響多個器官系統(tǒng)，包括心血管系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、胃腸道與肝臟等[5]。前期實(shí)驗(yàn)證明，因?qū)幤梢越档图卓捍笫蟮娜饧谞钕僭彼幔═3）、甲狀腺素（T4）、游離三碘甲狀腺原氨酸（FT3）、游離甲狀腺素（FT4）水平，升高促甲狀腺激素（TSH）水平，具有抗甲亢的作用[1，2]。

甲亢性肝損害臨床常見，其發(fā)生率國內(nèi)、外報(bào)道不一，國內(nèi)學(xué)者研究得出111例新診Graves患者中有52.6%存在肝功能異常[6]。甲亢性肝損害的發(fā)生機(jī)制主要有肝臟的氧化應(yīng)激反應(yīng)、肝細(xì)胞的凋亡等。本研究結(jié)果表明，因?qū)幤鲃┝拷M與空白對照組比較，肝功能指標(biāo)（ALT、AST、BIL、ALP、TP）均無顯著性差異，說明因?qū)幤瑢Ω闻K無毒性作用。與此同時，本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)：因?qū)幤瑢卓盒愿螕p害具有保護(hù)作用，可能機(jī)制如下：降低肝臟丙二醛（MDA）含量，增強(qiáng)超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）活性，提高抗氧化系統(tǒng)清除自由基的能力，糾正氧化和抗氧化系統(tǒng)失衡[2]；降低甲亢性肝損害大鼠肝臟脂肪酸合成酶（Fas）、Fas配體（FasL）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）的表達(dá)[7]；使甲亢大鼠肝細(xì)胞天冬氨酸蛋白酶（Caspase）-3蛋白表達(dá)明顯下調(diào)，B細(xì)胞淋巴瘤/白血?。˙cl）-2蛋白表達(dá)明顯上調(diào)[8]。

本研究結(jié)果表明，急性毒性實(shí)驗(yàn)未測出因?qū)幤腖D50，在MTD的情況下也未出現(xiàn)毒性反應(yīng)；慢性毒性實(shí)驗(yàn)在高劑量的情況下，大鼠一般狀況正常，未出現(xiàn)明顯毒性反應(yīng)和死亡，可見因?qū)幤容^安全。因?qū)幤瑢?shí)驗(yàn)大、小鼠的體重和攝食量都沒有影響。因?qū)幤鹘MRBC、HGB、HCT、LY、EO、PLT、NE、網(wǎng)織RBC、GLU、TP、ALb、TG較空白對照組有輕微變化，但均在允許范圍之內(nèi)[9]，產(chǎn)生原因尚不明確，可能的原因是昆明山海棠具有抗炎、免疫抑制等藥效學(xué)與毒理學(xué)性質(zhì)有關(guān)[10]，但在本組方中用量較小，無顯著性影響。

綜上，本文急性毒性和慢性毒性實(shí)驗(yàn)證明，因?qū)幤拘缘停蔀榕R床安全用藥提供理論依據(jù)。

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[8] 周 靜，王成蹊，潘弟儀.因?qū)幤瑢卓捍笫蟾渭?xì)胞凋亡調(diào)節(jié)蛋白Caspase-3和Bcl-2表達(dá)的影響[J].中國藥業(yè)，2011，20（11）：9.

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