G蛋白偶聯(lián)受體：七次跨膜結構的超級分子——2012年諾貝爾化學獎簡介

路偉振 吳蓓麗 趙 強③

①碩士，②③研究員，中國科學院上海藥物研究所，中國科學院受體結構與功能重點實驗室，上海201203

G蛋白偶聯(lián)受體：七次跨膜結構的超級分子
——2012年諾貝爾化學獎簡介

路偉振①吳蓓麗②趙 強③

①碩士，②③研究員，中國科學院上海藥物研究所，中國科學院受體結構與功能重點實驗室，上海201203

G蛋白偶聯(lián)受體 腎上腺素受體 七次跨膜結構

G蛋白偶聯(lián)受體是人類基因組中最大也是最重要的一類蛋白質(zhì)，它們幾乎參與了生物體中所有的生命活動。這一類受體的發(fā)現(xiàn)、功能研究以及結構解析為我們了解生理調(diào)控以及疾病的發(fā)生與治療等帶來新的曙光。在此之前，G蛋白偶聯(lián)受體的相關研究已經(jīng)被九次授予諾貝爾獎，而2012年，諾貝爾化學獎再次授予Robert J.Lefkowitz和Brian K.Kobilka，以表彰他們在此領域，尤其是腎上腺素受體上的相關研究。文中簡介了G蛋白偶聯(lián)受體的研究歷程，其獨特的七次跨膜結構與激活機制，并對此領域的未來發(fā)展做了展望。

G 蛋 白 偶 聯(lián) 受 體 （G-protein coupled receptor，GPCR）也稱為七次跨膜受體，是一類膜受體超家族，目前約有800多個成員，人類基因組中有超過2%的基因用來編碼G蛋白偶聯(lián)受體。G蛋白偶聯(lián)受體是細胞表面參與信號傳導的分子中數(shù)目最龐大的家族，它們可以感應無數(shù)種不同的細胞外信號，并進一步誘發(fā)相應的細胞反應。正是由于感光、感應化學分子的G蛋白偶聯(lián)受體的存在，才形成了我們的視覺、嗅覺和味覺等一系列的感知；而感應荷爾蒙的G蛋白偶聯(lián)受體更是參與了機體內(nèi)很多重要的生理過程，例如神經(jīng)遞質(zhì)傳遞、腺體中激素和酶的釋放、免疫反應、心肌和平滑肌的收縮以及血壓的調(diào)控等等。由于這些受體功能的多樣性與重要性，幾乎所有的人類疾病中都可以發(fā)現(xiàn)G蛋白偶聯(lián)受體的影子，這些受體功能的紊亂與調(diào)控的異常會導致相應疾病的發(fā)生，因此這一受體超家族一直被視為最好的藥物靶點。事實上，已經(jīng)證實現(xiàn)今藥物制劑作用的靶點中超過50%都是G蛋白偶聯(lián)受體［1］。

迄今為止，β2腎上腺素受體（β2AR）的相關研究就已經(jīng)兩次獲得諾貝爾獎。在1988年，James Black就由于在腎上腺素受體阻斷劑心得安（propranolol）方面的研究獲得諾貝爾生理學或醫(yī)學獎，而2012年的諾貝爾化學獎授予美國的兩名科學家Robert J.Lefkowitz和Brian K.Kobilka，以表彰他們在G蛋白偶聯(lián)受體研究中作出的突出貢獻，特別是對β2腎上腺素受體進行了高分辨率的結構解析和深入的功能研究，為揭示G蛋白偶聯(lián)受體的作用機制邁出了非常重要的一步。作為G蛋白偶聯(lián)受體相關研究所獲得的第10次諾貝爾獎，這一殊榮不僅將G蛋白偶聯(lián)受體的研究帶到了一個新的高度，也必然引起新一輪的G蛋白偶聯(lián)受體研究熱潮。

1 G蛋白偶聯(lián)受體的發(fā)現(xiàn)與研究歷程

G蛋白偶聯(lián)受體的發(fā)現(xiàn)已經(jīng)有很長的歷史，可以追溯到19世紀中期。1870年研究人員發(fā)現(xiàn)了光敏感的視紫質(zhì)（rhodopsin），在此基礎上，George Wald在1933年又發(fā)現(xiàn)了視紫紅質(zhì)，其后的幾十年間圍繞視紫紅質(zhì)開展了大量的工作，對其作用機制進行了深入的研究，并成為G蛋白偶聯(lián)受體研究的最重要的研究模型系統(tǒng)之一。但是在當時，并沒有人把感光系統(tǒng)與體內(nèi)激素的生理作用聯(lián)系起來。雖然受體理論在此之前就已經(jīng)創(chuàng)立，并在隨后得到迅速的發(fā)展，但是關于受體本身是什么物質(zhì)仍然是充滿了疑問與爭論，甚至有人質(zhì)疑受體是否真的存在。

1968年，Robert J.Lefkowitz開始利用放射性同位素追蹤細胞表面受體，β2腎上腺素受體的發(fā)現(xiàn)就得益于這種方法。首先他通過放射性同位素標記，證明細胞表面存在特異識別腎上腺素的物質(zhì)，接著他與他的研究小組發(fā)現(xiàn)利用去污劑可以增加這種特異性物質(zhì)的可溶性，并使用腎上腺素將其受體從細胞膜中抽離了出 來。 隨 后，Brian K.Kobilka 加 入 了 Robert J.Lefkowitz的研究團隊，開創(chuàng)性地將β2腎上腺素受體的編碼基因從倉鼠基因組中分離出來。通過序列比對，發(fā)現(xiàn)β2腎上腺素受體與牛視紫質(zhì)蛋白（rhodopsin）的氨基酸序列具有顯著的相似性，兩者都具有七次跨膜的區(qū)域。據(jù)此，Lefkowitz和Kobilka推斷rhodopsin和β2腎上腺素受體可能屬于同一家族，而這一家族可能編碼很多重要的激素受體。基于這一推論，Lefkowitz實驗室的Kobilka等很快成功克隆了編碼人類β2腎上腺素受體、人類血小板α2腎上腺素受體、5-羥色胺（5HTA1A）受體等在內(nèi)的一系列受體的基因。他們的這些工作都極大地推動了G蛋白偶聯(lián)受體研究的發(fā)展。2007年，Brian K.Kobilka和他的研究團隊解析出了人的β2腎上腺素受體的晶體結構，這一突破性的研究成果拉開了人類G蛋白偶聯(lián)受體晶體結構解析的序幕?？v觀β2腎上腺素受體的研究歷程，我們可以想象出這項工作的艱巨，花費如此長的時間才得到其三級結構也就不足為奇了。

2 G蛋白偶聯(lián)受體的結構研究

通過結構預測，研究人員很早就得知G蛋白偶聯(lián)受體的結構為一個由7個α螺旋組成的跨膜結構，此外一小部分受體還包含胞外的N端或胞內(nèi)的C端結構域，與此同時，早期的一些結構生物學研究得到的較低分辨率的結構也給出了這7個α跨膜螺旋的大致走向。但是這些粗略的結構無法解釋為何同樣是七次跨膜結構，數(shù)百個不同的G蛋白偶聯(lián)受體家族卻能特異地識別小到光子，大到蛋白這些無論在體積還是在形狀、性質(zhì)上均有很大差別的底物分子，以及底物分子結合后，受體又是如何將信號進一步傳遞給不同的細胞內(nèi)信號通路的。G蛋白偶聯(lián)受體的三維結構解析工作歷來被認為是最有挑戰(zhàn)性的結構生物學研究之一，早期研究人員在此方向上花費了無數(shù)的心血卻進展甚微。研究人員第一次了解G蛋白偶聯(lián)受體的結構來自于對視紫紅質(zhì)二維結構的檢測，雖然當時得到的結構分辨率比較低，卻第一次觀察到G蛋白偶聯(lián)受體跨膜區(qū)域的構象，成為其他G蛋白偶聯(lián)受體研究的分子模型［2－4］。2000年，Science雜志的封面文章介紹了視紫紅質(zhì)晶體結構的研究結果，從而揭開了G蛋白偶聯(lián)受體結構的神秘面紗，成為G蛋白偶聯(lián)受體結構研究領域中的一個重要里程碑，奠定了其他G蛋白偶聯(lián)受體結構研究的基礎［5］。視紫紅質(zhì)作為G蛋白偶聯(lián)受體結構研究的模型也有其天然的優(yōu)勢：一方面人們可以從牛視網(wǎng)膜中獲得大量高純度的視紫紅質(zhì)，另外一方面則因為視紫紅質(zhì)非常穩(wěn)定，在其他G蛋白偶聯(lián)受體變性的環(huán)境中仍然能保持活性狀態(tài)［2，6］。2005年，Wayne A.等獲得了FSHR（follicle-stimulating hormone receptor）N端配體結合結構域與配體結合的復合體，其晶體結構研究成果在Nature上發(fā)表，為結合糖蛋白類激素的受體的結構研究開辟了先河；然而，美中不足的是解析出來的結構缺少跨膜區(qū)的結構域［7］。之后的兩年中，沒有其他的G蛋白偶聯(lián)受體結構被解析出來，對G蛋白偶聯(lián)受體的研究也一直停留在利用定點突變和半胱氨酸掃描突變的方法檢測受體和配體的相互作用［8］。

G蛋白偶聯(lián)受體的三維結構研究停滯的局面一直持續(xù)到2007年才得以打破。在這一年，Brian Kobilka和Raymond Stevens研究組共同解析了β2腎上腺素受體的高分辨率三維結構。在此工作中，兩個研究組分別做出了開創(chuàng)性的貢獻：Brian Kobilka首次運用在受體中插入可溶性蛋白片段的方法，這一可溶蛋白片段能顯著提高受體的穩(wěn)定性，并且有效地輔助晶體形成；Raymond Stevens則將脂立方相（lipidic cubic phase）這一結晶學新概念引入G蛋白偶聯(lián)受體的結構研究中，并進一步發(fā)展出如FRAP，LCP-Tm等一系列脂立方相工具用于結晶實驗。隨著融合蛋白和脂立方相概念的推廣，G蛋白偶聯(lián)受體的三維結構解析不再是一個個單獨的個案，開始變得有跡可循。至今研究人員共解析了14個G蛋白偶聯(lián)受體的三維結構，其中有12個受體的結構解析采用了融合蛋白和脂立方相的方法，這些結構也基本上都是由這兩家實驗室完成或者參與完成的。

在解析了β2腎上腺素受體的結構之后，Brian Kobilka和Raymond Stevens研究組的研究方向開始有了不同的側(cè)重。其中，Raymond Stevens研究組更側(cè)重于新的受體結構解析。他們又陸續(xù)解析了A2A腺苷受體，CXCR4趨化因子受體以及D3多巴胺受體等7個受體的三維結構。這些新解析出的結構表明，雖然同樣是七次跨膜，但是小分子受體、磷脂分子受體、小分子和多肽受體等在跨膜螺旋的走向以及胞外環(huán)的結構上都有許多不同的結構特征，而這些結構特征又與其生理功能息息相關。在這些結果的幫助下，研究人員已經(jīng)初步掌握一些G蛋白偶聯(lián)受體與其配體識別并相互作用的規(guī)律，并可據(jù)此對未知受體的相關信息進行預測。當然Raymond Stevens研究組的結果也表明，這一預測僅僅局限于一小部分我們了解得比較清楚的受體中，而針對大部分受體的預測仍然與實驗數(shù)據(jù)相差甚遠［9］。

與 Raymond Stevens研究組不同，Brian Kobilka研究組在解析了β2腎上腺素受體的結構之后更偏重于信號傳導的研究。他們?nèi)匀灰驭?腎上腺素受體為模型，進一步解析了其與拮抗劑、激動劑以及G蛋白這一重要下游信號分子等各種復合物的三維結構。這些結果幫助研究人員進一步認識不同類型底物如何被受體識別，誘發(fā)受體發(fā)生構象變化并進一步將胞外的信號傳導到細胞內(nèi)。其中，β2腎上腺素受體與G蛋白復合物的三維結構是G蛋白偶聯(lián)受體研究中的里程碑式成果，它清楚地向研究人員展示了兩者之間是如何相互作用的，G蛋白又是如何被受體激活的，從而為后續(xù)的各項研究打下堅實的結構基礎。

3 G蛋白偶聯(lián)受體的結構

在Brian Kobilka和Raymond Stevens等人的努力下，我們現(xiàn)在已經(jīng)比較清楚地了解了G蛋白偶聯(lián)受體的三維拓撲結構。除了七次跨膜螺旋，受體分子還包含三個胞內(nèi)環(huán)以及三個胞外環(huán)結構。在三個胞內(nèi)環(huán)中，一般前兩個胞內(nèi)環(huán)較短，沒有特定的生理功能；第三個胞內(nèi)環(huán)則變化較大，在不同的受體中長度可能從幾個氨基酸到一百余個氨基酸殘基不等。三個胞內(nèi)環(huán)中，通常第三個胞內(nèi)環(huán)的功能最為重要，涉及G蛋白偶聯(lián)受體與G蛋白的識別及相互作用；但同時也由于其柔性太大，通常會被可溶蛋白片段取代或者缺乏均一的構象，所以到目前為止具體的結構仍不清楚。與此類似的，三個胞外環(huán)中，同樣第一個以及第三個胞外環(huán)較短，沒有明確的生物學功能；而第二個胞外環(huán)在不同的受體中差異比較大，有可能形成α螺旋，也有可能是β折疊，還有一部分受體的環(huán)區(qū)較短，僅形成簡單的無規(guī)則環(huán)區(qū)。第二個胞外環(huán)通常會形成一個類似蓋子的結構罩住底物結合位點，不但有可能對底物的進出造成影響，其部分殘基也參與了與底物的結合，它與螺旋一起形成了特異的選擇機制。

受體的跨膜螺旋形成兩個片層：螺旋I-IV形成一個片層，螺旋V-VII形成另外一個片層，兩個片層共同形成七次跨膜螺旋桶結構（圖1A）。在7個螺旋中，通常有螺旋II，III，VI，VII形成底物結合口袋，負責特異地識別底物分子；而螺旋V則會與底物分子形成一定的接觸，并根據(jù)不同的底物形成相應的構象，進一步調(diào)節(jié)受體的不同活性。構成受體的7個螺旋并不完全是筆直的α螺旋，其中的大部分，尤其是V，VI，VII三個螺旋在中部都存在不利于螺旋結構形成的脯氨酸，從而稍稍打斷形成彎折的螺旋結構（圖1B）。正是由于這些彎折傾斜的存在，使得由于底物結合而引發(fā)的胞外區(qū)螺旋的微小擾動被放大，造成細胞內(nèi)螺旋的巨大構象變化，從而激發(fā)下游信號分子。

得益于Brian Kobilka以及Raymond Stevens等人的出色工作，我們現(xiàn)在已經(jīng)能夠比較清楚地了解G蛋白偶聯(lián)受體在激活前后的構象變化（圖2A）。在底物分子與受體結合后，受體螺旋的胞外區(qū)并沒有太大的變化，僅僅部分螺旋發(fā)生2?左右的微小位移，但是在胞內(nèi)區(qū)卻誘發(fā)了巨大的結構改變。其中，螺旋片層I-IV的位置保持相對固定，而螺旋V發(fā)生輕微的旋轉(zhuǎn)并導致螺旋長度向胞內(nèi)區(qū)繼續(xù)延伸至少兩個螺旋，同時螺旋VI則向外延展超過14?。這兩個螺旋的變化導致受體胞內(nèi)區(qū)的螺旋桶形成巨大的空間，使得G蛋白的一部分可以結合在此空隙中；而與螺旋V，VI的外展不同，螺旋VII稍微內(nèi)收，并與G蛋白發(fā)生一定的相互作用，共同識別并行使信號傳導功能（圖2B，圖2C）。

圖1 G蛋白偶聯(lián)受體的結構模型，分別從A）底物結合口袋方向以及B）脂雙層方向觀測。蛋白的七次跨膜按照從螺旋I-螺旋VII的順序顏色依次從藍色到紅色漸變

圖2 G蛋白偶聯(lián)受體的激活。A）G蛋白偶聯(lián)受體與G蛋白復合物的三維結構。其中，淺褐色部分代表G蛋白偶聯(lián)受體，綠色代表G蛋白α亞基，天藍色代表G蛋白β亞基，紫色代表G蛋白γ亞基。B）G蛋白偶聯(lián)受體處于活性與非活性狀態(tài)的胞內(nèi)結構比較。其中綠色和藍色分別代表活性狀態(tài)下以及非活性狀態(tài)下的受體結構［10］。C）G蛋白偶聯(lián)受體處于活性與非活性狀態(tài)的胞內(nèi)結構比較示意圖［11］。箭頭代表相應的區(qū)域在受體激活后發(fā)生的結構變化

4 β2腎上腺素受體研究進展

近40年來，β2腎上腺素受體都作為G蛋白偶聯(lián)受體家族研究的模型，它是第一個通過放射性配體結合進行研究的G蛋白偶聯(lián)受體，也是第一個用結晶學方法進行 結構研究的 神 經(jīng) 遞 質(zhì) 受 體［6，10，12－13］。 盡 管 越 來 越 多 的證據(jù)表明，GPCR存在二聚體，并且這些二聚體可能與一些GPCR的活化有關［2］，然而β2腎上腺素受體的活化不需要發(fā)生二聚化，其在晶體結構中以單體形式存在，而且純化的β2腎上腺素受體也以單體形式存在，單體的β2腎上腺素受體整合到重組的高密度脂蛋白顆粒，從而與Gs蛋白偶聯(lián)［14］。激動劑與β2腎上腺素受體結合后促進了其與GDP結合的αβr異源三聚體的相互作用，導致GDP和GTP的交換，Gs分離為Gα-GTP和Gβr亞基，分離后的兩個亞基可以調(diào)控不同細胞效應因子的活性，Gαs固有的 GTP酶活性將 GTP水解為GDP，而Gα-GDP和Gβr重新結合后終止了信號的傳導（圖3）。β2腎上腺素受體被腎上腺素激活后，在心血管疾病以及肺功能方面有著重要的作用，人們已經(jīng)通過定點突變的方法鑒定出β2腎上腺素受體與配體相互作用的位點［10］。

在β2腎上腺素受體中存在著一定的結構疏松區(qū)域，蛋白酶敏感實驗和分子內(nèi)熒光共振能量轉(zhuǎn)移實驗表明疏松的結構主要位于β2腎上腺素受體的C末端和第三個胞內(nèi)環(huán)，這些區(qū)域在蛋白-蛋白之間的相互作用過程中有著重要的作用。對于水溶性蛋白來說，去除這些結構疏松區(qū)有利于晶體的形成，而對于β2腎上腺素受體來說，這樣的做法會減少它的親水表面進而導致晶格間的相互聯(lián)系。β2腎上腺素受體中C端結構域的第二和第三個胞質(zhì)環(huán)參與了與G蛋白的相互作用，通過N端結構域和第三個胞內(nèi)環(huán)的C端促進G蛋白的活化，C端結構域則與G蛋白偶聯(lián)受體激酶、抑制劑和其他的一些信號分子相互作用［15－17］。

圖3 β2AR-Gs蛋白復合物中G蛋白循環(huán)示意圖［12］

為了進一步對β2腎上腺素受體的結構和功能進行研究，理解G蛋白偶聯(lián)受體信號傳導的結構基礎，Brian K.Kobilka嘗試獲得β2腎上腺素受體-Gs蛋白復合體。然而這樣的工作面臨一個很大的問題，就是在去垢劑存在的條件下如何得到穩(wěn)定的β2AR-Gs復合體。雖然β2AR-Gs在磷脂雙分子層中可以有效地發(fā)生偶聯(lián)，但是在加入去垢劑后其偶聯(lián)效率急劇下降。后來Brian K.Kobilka發(fā)現(xiàn)在十二烷基麥芽糖苷溶液中，純化的GDPGs和過量的與高親和力配體結合的β2腎上腺素受體可以形成復合體［17］，然后加入三磷酸腺苷雙磷酸酶將GDP從Gs-GDP復合體上水解下來，就能夠得到穩(wěn)定的β2AR-Gs復合體。在這個過程中，將GDP從復合體上水解下來是非常有必要的，因為GDP或者GTP的存在都會破壞β2腎上腺素受體和Gs的相互作用。2011年Brian K.Kobilka終于順利解析出了β2AR-Gs蛋白復合體的晶體結構，研究成果發(fā)表在Nature上。他發(fā)現(xiàn)在這個復合體中，Gs與GTP的親和力遠高于其與GDP的親和力，并且當β2腎上腺素受體與Gs結合后與配體的親和力比β2腎上腺素受體單獨存在時高出了近100倍。β2AR-Gs復合體結構的解析是人們第一次通過一個G蛋白偶聯(lián)受體來研究橫跨質(zhì)膜的信號傳導機制，為激動劑-β2AR-Gs三聚體的功能分析提供了結構基礎［10］。同年，Brian K.Kobilka又實現(xiàn)了另一突破，他利用抗體片段代替G蛋白，成功得到了抗體片段-激動劑-活化的β2腎上腺素受體三者的復合體，捕捉到在向細胞發(fā)送信號時的β2腎上腺素受體圖像。與之前只能解析出非活化狀態(tài)的G蛋白偶聯(lián)受體結構相比，他的這一工作使G蛋白偶聯(lián)受體結構和功能的研究又上了一個新的臺階［18］。

與Brian K.Kobilka在β2腎上腺素受體結構解析方面作出的貢獻相比，Robert J.Lefkowitz則對β2腎上腺素受體的功能及其介導的信號通路做了深入的研究，尤其對β-抑制蛋白在信號通路中的作用機制及功能做了全面解析。2011年，Robert J.Lefkowitz闡述了慢性應激反應和DNA損傷之間的關系，其研究成果在Nature上發(fā)表。流行病學研究已經(jīng)證實慢性應激反應會導致DNA損傷，應激反應誘導了DNA損傷后會加快人體老化，引發(fā)腫瘤形成以及一些精神疾病的發(fā)生，但是人們對DNA損傷的機制還不清楚。在這篇文章里Robert J.Lefkowitz就對其分子機制做了詳細的闡述，兒茶酚胺類配體與β2腎上腺素受體結合后，活化了β2腎上腺素受體，通過Gs-PKA和β-抑制蛋白信號通路，分別造成DNA的損傷和P53水平的下降，協(xié)同導致了DNA損傷的積累。在這篇文章中Robert J.Lefkowitz還解釋了β抑制蛋白新的功能，即在細胞核中作為E3連接酶的連接子，促進E3連接酶與P53的相互作用，進而導致了P53的泛素化程度增加，最后發(fā)生降解［19］。他的這一發(fā)現(xiàn)再次引起轟動，為腫瘤以及神經(jīng)系統(tǒng)等相關疾病的診斷提供了理論依據(jù)。同年，Robert J.Lefkowitz和他的研究團隊利用質(zhì)譜定量分析的策略，用同位素和琥珀酰苷分別標記半胱氨酸的巰基和賴氨酸的氨基，檢測標記的氨基酸的特定反應來研究β2腎上腺素受體與不同的配體結合時動態(tài)的構象變化。這種方法提供了各自側(cè)鏈特定的反應信息，鑒定了β2腎上腺素受體與不同配體結合時的構象變化［20］。Robert J.Lefkowitz和Brian K.Kobilka在GPCR領域所取得的成就令人折服，他們創(chuàng)造性的研究方法也為今后GPCR的研究工作開辟了蹊徑。

5 G蛋白偶聯(lián)受體研究現(xiàn)狀及問題

G蛋白偶聯(lián)受體的7個跨膜疏水區(qū)有很高的保守性，而N端、C端和跨膜結構域之間的連接區(qū)保守性相對比較低。不同種類的配體在G蛋白偶聯(lián)受體上的結合位點也不相同，小分子配體主要結合在G蛋白偶聯(lián)受體7個α螺旋跨膜結構圍成的疏水區(qū)，肽段和蛋白質(zhì)結合的區(qū)域則位于N端結構域和胞外的親水環(huán)［21－22］。根據(jù)序列同源性和功能相似性進行區(qū)分，G蛋白偶聯(lián)受體一共可以分為六大類，每一大類又可以分為很多不同的亞類，其中數(shù)目最多的視紫紅質(zhì)樣受體可以分為19個亞類。配體也可以根據(jù)其與受體結合后產(chǎn)生不同的效應分為幾類：第一類是完全激動劑，與受體結合后可以最大程度地激活受體；第二類是部分激動劑，在飽和濃度下也不能完全激活受體；第三類是中立的拮抗劑，與受體結合后不產(chǎn)生明顯的信號傳導效應，但是卻可以阻止其他的配體與受體結合；還有一類就是拮抗劑，與受體結合后會降低受體的本底活性。受體的活性因所結合配體種類的不同會增加或者下降，這樣看來，G蛋白偶聯(lián)受體就更像是一個分子變阻器而不是一個簡單的分子活性開關，與配體結合后既可以表現(xiàn)出最大的活性，也可以表現(xiàn)出不同程度的部分活性。找出不同G蛋白偶聯(lián)受體亞類作用機制和功能的不同是一項非常有意義的工作，尤其是對于那些高度保守的成員，區(qū)分不同的受體類型后就可以采用相應的藥物進行治療。通?？梢圆扇煞N方法區(qū)分不同的G蛋白偶聯(lián)受體亞類：第一種就是鑒定出受體的類型及其調(diào)控的生理過程，另一種就是找出可以選擇性地與相應的一個或者一類受體結合的配體。但是，傳統(tǒng)的藥物療法通常不能區(qū)分同源性比較高的G蛋白偶聯(lián)受體，所以，盡管利用選擇性配體對G蛋白偶聯(lián)受體功能的研究非常重要，卻很難找到選擇性很高的配體［21］。

研究表明G蛋白偶聯(lián)受體存在多種、配體特異性的構象狀態(tài)。Brian K.Kobilka曾經(jīng)用能量圖的方式直觀地描述蛋白受體構象動態(tài)變化的過程，他把沒有結合配體時的受體狀態(tài)定義為最低能量狀態(tài)，不同的構象之間存在著能量差異，即低能量構象狀態(tài)向高能量構象狀態(tài)轉(zhuǎn)化時，需要克服一定的能壘，能量變化的寬度則反映出受體構象變化的靈活性。對于一個受體來說，配體結合的能量可以作為非活化狀態(tài)到活化狀態(tài)所需的能量，也可以用來減少或增加了兩種狀態(tài)間的能量差值，或者兩種情況都存在［22］。

與視紫紅質(zhì)不同，很多G蛋白偶聯(lián)受體表現(xiàn)出不依賴配體結合的本底活性，例如β2腎上腺素受體因其開放的結構使得它在結合抑制劑的情況下仍保留了一部分的本底活性。受體的本底活性與結構的不穩(wěn)定有關，分子內(nèi)的相互作用使受體維持在非活化狀態(tài)，G蛋白偶聯(lián)受體第三個跨膜區(qū)存在一段保守序列E／DRY，它們可以和第六個跨膜區(qū)上的谷氨酸殘基形成離子鎖，這也是配體活化的G蛋白偶聯(lián)受體和視紫紅質(zhì)在結構上的一個主要差別。在A類G蛋白偶聯(lián)受體家族中，這些氨基酸殘基通過極性相互作用形成一個網(wǎng)絡結構，像一座橋梁一樣連接著兩個跨膜螺旋，穩(wěn)定了非活化狀態(tài)的構象。對于β2腎上腺素受體來說，這些位點的突變可以增加β2腎上腺素受體的本底活性，并且研究表明，完全激動劑和部分激動劑與受體結合后都可以改變離子鎖附近的結構，破壞分子內(nèi)的相互作用。對于那些缺少完整的離子鎖的晶體來說，可能有兩種原因造成這種情況：第一種是因為這種相互作用不存在于結合配體的受體中，另外一種就是這種相互作用非常弱以致在晶體生長的過程中消失［23］。

受體活化可能主要通過兩種機制：首先是配體的結合打破G蛋白偶聯(lián)受體胞質(zhì)內(nèi)固有的相互作用，即破壞離子鎖附近的結構；其次是產(chǎn)生新的相互作用，包括配體上化學取代基和G蛋白偶聯(lián)受體上特定氨基酸殘基之間的相互作用等等，這是一個非常復雜的過程。配體就像一座橋，介導G蛋白偶聯(lián)受體跨膜結構域之間的聯(lián)系，進而形成一個更加有活性的構象狀態(tài)，并且影響跨膜結構域的空間排布［22］。

G蛋白偶聯(lián)受體是一種多能的信號分子，這可能源于它們靈活多變的三維空間結構。先前采用生物傳感器和體外熒光標記的方法研究七次跨膜蛋白存在的不同的構象，盡管這些研究可以觀察到激動劑誘導的受體構象的變化，但是并不十分準確，而且缺乏系統(tǒng)性。同時，盡管X射線衍射已解析出多種七次跨膜蛋白結構，可以提供靜態(tài)原子水平的結構信息，但是仍然存在一定的局限性。為了獲得這些動態(tài)分子高分辨率的晶體衍射數(shù)據(jù)，我們會采取一定措施減少這些受體結構的靈活性，例如用T4L取代高度可變的ICL3以及與抗體共結晶以穩(wěn)定受體構象，所以這些結構并不能展示未經(jīng)修飾的七次跨膜區(qū)復雜的動態(tài)過程。尋找能夠檢測跨膜區(qū)動態(tài)變化過程的方法對于研究其在信號轉(zhuǎn)導過程中的作用和活化的機制就顯得尤為重要，更好地理解這些動態(tài)特征對基于結構的藥物研發(fā)來說有著重要的意義［20］。然而，這種動態(tài)的變化也給結構分析帶來了巨大的挑戰(zhàn)。晶體的形成需要穩(wěn)定的、構象均一的蛋白，人們很難獲得沒有結合配體的天然的G蛋白偶聯(lián)受體晶體；即便獲得了這樣的晶體，也可能只是得到了晶體眾多天然構象中的一種。盡管目前的NMR技術還很難獲得高分辨率的晶體結構數(shù)據(jù)，但是NMR是研究這些蛋白動態(tài)過程的最有可能的方法［23］。

6 G蛋白偶聯(lián)受體研究展望

隨著技術的不斷改進，現(xiàn)在解析出一種G蛋白偶聯(lián)受體結構所需要的時間也越來越短，到目前為止，已經(jīng)有十幾種G蛋白偶聯(lián)受體的結構被解析出來。G蛋白偶聯(lián)受體研究工作快速推進的同時，也對人們提出了更高的要求，不僅僅局限于單純地獲得其晶體結構，G蛋白偶聯(lián)受體的活化機制以及結構與功能的關系，也都成為人們關注的焦點。G蛋白偶聯(lián)受體活化時都發(fā)生了哪些構象變化，配體是通過什么機制誘導了受體構象的變化等等一系列的問題都亟待解決。晶體結構信息對G蛋白偶聯(lián)受體藥物的研發(fā)有很大的幫助，雖然越來越多的G蛋白偶聯(lián)受體晶體結構被解析出來，但是這些模型對藥物研發(fā)者來說仍然顯得不夠精確。分子停靠實驗表明，非活化狀態(tài)的G蛋白偶聯(lián)受體結構只有在鑒定那些穩(wěn)定非活化狀態(tài)結構的配體時結果才可信［23］；因此除了對G蛋白偶聯(lián)受體進行結晶外，還需要發(fā)展一些新的方法去獲得受體和激動劑結合時的結構。只有G蛋白偶聯(lián)受體與激動劑結合才能提供受體活化狀態(tài)的三維構象，這些結構將有助于闡明構象變化與配體結合之間的關系，G蛋白偶聯(lián)受體靶向的藥物療法既包括激動劑也包括反激動劑，所以這些結構將會對藥物化學和藥理學的研究產(chǎn)生深遠的影響。

（2012年11月20日收到）

［1］PIERCE K L，PREMONT R T，LEFKOWITZ R J.Seven transmembrane receptors ［J］.Nature Rev Mol Cell Biol，2002，3：639-650.

［2］KOBILKA B K.G protein coupled receptor structure and activation［J］.Biochim Biophys Acta，2007，1768（4）：794-807.

［3］UNGER V M，HARGRAVE P A，BALDWIN J M，et al.Arrangement of rhodopsin transmembrane alpha-helices［J］.Nature，1997，389：203-206.

［4］SCHERTLER G F，VILLA C，HENDERSON R.Projection structure of rhodopsin［J］.Nature，1993，362：770-772.

［5］PALCZEWSKI K，KUMASAKA T，MIYANO M.Crystal structure of rhodopsin：a G protein-coupled receptor［J］.Science，2000，289：739-745.

［6］RASMUSSEN S G F，CHOI H J，ROSENBAUM D M，et al.Crystal structure of the humanβ2 adrenergic G-protein-coupled receptor［J］.Nature，2007，450：383-387.

［7］FAN Q R，HENDRICKSON W A.Structure of human follicle-stimulating hormone in complex with its receptor［J］.Nature，2005，433：269-277.

［8］SHI L，JAVITCH J A.The binding site of aminergic G protein-coupled receptors：the transmembrane segments and second extracellular loop ［J］.Annu Rev Pharmacol Toxicol，2002，42：437-467.

［9］MICHINO M，CHEN J，STEVENS R C.FoldGPCR：structure prediction protocol for the transmembrane domain of G protein coupled receptors from class A ［J］.Proteins，2010，78：2189-2201.

［10］RASMUSSEN S G F，DEVREE B T，ZOU Y，et al.Crystal structure of theβ2 adrenergic receptor-Gs protein complex［J］.Nature，2011，477：549-555.

［11］XU F，WU H，KATRITCH V，et al.Structure of an agonistbound human A2A adenosine receptor ［J］.Science，2011，332：322-327.

［12］DIXON R A F，KOBILKA B K，STRADER D J，et al.Cloning of the gene and cDNA for mammalianβ-adrenergic receptor and homology with rhodopsin［J］.Nature，1986，321：75-79.

［13］ROSENBAUM D M，CHEREZOV V，HANSON M A，et al.GPCR engineering yields high-resolution structural insights intoβ2-adrenergic receptor function［J］.Science，2007，318：1266-1273.

［14］WHORTON M R.A monomeric G protein-coupled receptor isolated in a high density lipoprotein particle efficiently activates its G protein［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2007，104：7682-7687.

［15］GRANIER S.Structure and conformational changes in the C-terminal domain of theβ2-adrenoceptor：insights from fluorescence resonance energy transfer studies［J］.J Biol Chem，2007，282：13895-13905.

［16］GETHER U，KOBILKA B K.G protein-coupled receptors.II.mechanism of agonist activation［J］.J Biol Chem，1998，273：17979-17982.

［17］REITER E，LEFKOWITZ R J.GRKs andβ-arrestins：roles in receptor silencing，trafficking and signaling ［J］.Trends Endocrinol Metab，2006，17：159-165.

［18］RASMUSSEN S G F，CHOI H J，F(xiàn)UNG J J，et al.Structure of a nanobody-stabilized active state of theβ2 adrenoceptor［J］.Nature，2011，469：175-180.

［19］HARA M R，KOVACS J J，LEFKOWITZ R J.A stress response pathway regulates DNA damage throughβ2-adrenoreceptors andβ-arrestin-1［J］.Nature，2011，477：349-353.

［20］KAHSAI A W，XIAO K，LEFKOWITZ R J.Multiple ligandspecific conformations of theβ2-adrenergic receptor［J］.Nat Chem Biol，2011，7：692-700.

［21］ROHRER D K，KOBILKA B K.G protein-coupled receptors：functional and mechanistic insights through altered gene expression［J］.Physiological Reviews，1988，78：35-52.

［22］KOBILKA B K，DEUPI X.Conformational complexity of G-protein-coupled receptors［J］.Trends in Pharmacological Sciences，2007，28：398-406.

［23］ROSENBAUM D M，KOBILKA B K.The structure and function of G-protein-coupled receptors［J］.Nature，2009，459：356-363.

G Protein Coupled Receptors，the Magic Molecules with Seven Transmembrane Helices：A Brief Introduction to the Nobel Prize in Chemistry 2012

LU Wei-zhen①，WU Bei-li②，ZHAO Qiang③
① ② ③Professor，CASKeyLaboratoryofReceptorResearch，ShanghaiInstituteofMateriaMedica，ChineseAcademyofSciences，Shanghai201203，China

G protein coupled receptors are the largest and the most important protein family in human genome，which involved in almost all of the living activities.The gene cloning，functional studies and structural determination of these receptors shed a new light on understanding the physiological regulation and the pathogenicity and treatment of almost all the human diseases.The Nobel Prize had issued to related research for 9 times，and in 2012，the Nobel Prize in Chemistry was issued to two American scientists，Robert J.Lefkowitz and Brian K.Kobilka，for their extraordinary work on this area，especially onβ2 adrenergic receptors.In this paper，we briefly reviewed the research progresses of G protein coupled receptors in the past，their unique 7transmembrane architecture，activation mechanism and their future trends.

G protein coupled receptor，adrenergic receptor，7 transmembrane architecture

10.3969／j.issn.0253-9608.2012.06.005

（編輯：沈美芳）