益生菌的篩選及安全性研究進(jìn)展

董秋月，陳檬燕，辛楊，秦雪艷，程卓，石陸娥

（杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 310036）

隨著生活水平的提高，大家開始更多地關(guān)注健康，人們對(duì)食品的要求也不再僅限于滿足最基本的生理需求。于是，像益生菌、益生元這類有益于身體健康的食品添加劑逐漸吸引了人們的眼球。雖然目前益生菌的多種益生性能已經(jīng)被大家所認(rèn)可，但是益生菌制品卻沒有得到充分的開發(fā)。這主要是因?yàn)橐嫔谋２夭灰?，更重要的是益生菌的種類繁多。篩選出動(dòng)物體內(nèi)的不同益生菌，研究益生菌的生理生化特性，進(jìn)行安全性鑒定是近年來微生物研究中重要的重要組成部分[1]。益生菌在促進(jìn)人體健康和防止疾病中發(fā)揮著重要的作用，是未來功能食品發(fā)展的重要領(lǐng)域。

1 益生菌的來源、種類

益生菌來源主要是動(dòng)物腸道正常生理性菌和非腸道菌。科學(xué)家已發(fā)現(xiàn)的益生菌大體上分成3大類，其中包括：（1）乳酸桿菌類（如嗜酸乳桿菌、干酪乳桿菌、詹氏乳桿菌、拉曼乳桿菌、短乳桿菌、保加利亞乳桿菌等）；（2）雙歧桿菌類（如長(zhǎng)雙歧桿菌、短雙歧桿菌、卵形雙歧桿菌、嗜熱雙歧桿菌、青春雙歧桿菌等）[2]；（3）革蘭氏陽性球菌（如糞鏈球菌、乳球菌、中介鏈球菌等）。此外，還有一些釀酒酵母菌、布氏酵母菌、部分霉菌與非致病性大腸桿菌亦可歸入益生菌的范疇。

2 益生菌的選擇[3]

2.1 安全性要求

（1）人類用的益生菌要來自于人體；（2）分離來自于健康人的胃腸道；（3）不能產(chǎn)生某些疾?。ㄈ缧膬?nèi)膜炎或胃腸道紊亂）；（4）沒有可傳遞的抗生素基因。

2.2 功能性要求

（1）耐膽汁；（2）耐酸和耐胃液；（3）可黏附在胃腸道等上皮表面并且能夠存活（定植和黏附力）；（4）刺激免疫系統(tǒng)，提高免疫力，并不引起某些炎癥；（5）對(duì)病原菌有拮抗作用（抑菌作用），如幽門螺桿菌、沙門氏菌桿菌、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌等；（6）有抗誘變和防癌功能。

2.3 加工性要求

（1）成本低廉且容易處理；（2）具有好的感官特性；（3）能夠抗噬菌體；（4）在產(chǎn)品和儲(chǔ)藏過程中能夠保持穩(wěn)定性；（5）在加工過程中能夠保證穩(wěn)定有效的活菌數(shù)。

3 益生菌的傳統(tǒng)分類篩選方法

傳統(tǒng)的分類鑒定方法通常指表型分類法，包含形態(tài)特征、生理生化反應(yīng)、血清學(xué)反應(yīng)等，方法原理都是基于微生物表面受體的特異性。

形態(tài)結(jié)構(gòu)和培養(yǎng)特征試驗(yàn)：形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察是指利用顯微鏡對(duì)被染色的微生物形狀、大小、排列方式、細(xì)胞結(jié)構(gòu)及染色特性進(jìn)行鏡下直接觀察。不同微生物在相同的培養(yǎng)基中形成的菌落特征有很大的差異，而在一定的條件下，同一種微生物的培養(yǎng)特征具有一定的穩(wěn)定性，因此可以區(qū)別不同微生物的一依據(jù)[4]。

細(xì)菌生理生化試驗(yàn)：包括含碳化合物利用、淀粉水解試驗(yàn)、糖或醇類發(fā)酵試驗(yàn)、過氧化氫測(cè)定等。

4 益生菌的敏感性和存活力

采用濾紙片抑菌圈法或牛津杯法可辨別不同種類益生菌對(duì)各種抗生素的敏感性，馬艷等[5]進(jìn)行了益生菌對(duì)抗生素的敏感性實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明：乳酸菌對(duì)鹽酸林可霉素、慶大霉素敏感，而對(duì)丁胺卡那霉素不敏感；芽抱桿菌對(duì)慶大霉素敏感，對(duì)鹽酸林可霉素不敏感，對(duì)丁胺卡那霉素中度敏感，視具體情況配伍使用；糞鏈球菌對(duì)慶大霉素敏感，而對(duì)鹽酸林可霉素、丁胺卡那霉素不敏感；而3種菌的復(fù)合菌可以分別與以上3種抗生素混合使用。

有研究發(fā)現(xiàn)要獲得所期望的治療效果，益生菌的數(shù)量必須達(dá)到足夠的數(shù)量。因此提高益生菌活菌數(shù)量己成為商業(yè)中的重點(diǎn)研究課題。日前，提高生菌存活力的方法有[6]：（1）選擇耐酸和耐膽鹽的菌株，有助于提高原生菌的生存能力；（2）選擇合適的接種量；（3）利用二步發(fā)酵法，可以使產(chǎn)品中的益生菌數(shù)量比原來提高4倍～5倍；（4）微膠囊技術(shù)，以此來降低細(xì)胞的損傷或死亡；（5）抗性調(diào)整，有助于提高益生菌體對(duì)不同環(huán)境的耐受性；（6）添加微量營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)如蛋白質(zhì)、肽和氨基酸；（7）添加抗壞血酸（作為除氧劑）；（8）選擇合適的包裝容器；（9）利用超聲波降解乳酸菌釋放a-半乳糖酶。

5 益生菌功能性的研究進(jìn)展

5.1 緩解腹瀉和調(diào)節(jié)腸道菌群的功能

根據(jù)研究表明，益生菌能夠預(yù)防和改善腹瀉，由于飲食習(xí)慣或食用抗生素均會(huì)打破腸道菌群的平衡，從而會(huì)導(dǎo)致腹瀉，補(bǔ)充益生菌能夠增加腸道蠕動(dòng)，防止細(xì)菌過度生長(zhǎng)，調(diào)節(jié)腸道菌群及恢復(fù)腸道正常的pH值，從而提高腸道機(jī)能，緩解腹瀉癥狀[7]。具有改善胃腸道功能的益生菌必須具備某種特性才能在微環(huán)境中保持優(yōu)勢(shì)，如鉆附、競(jìng)爭(zhēng)排斥、占位和產(chǎn)生抑制物等。以雙岐桿菌和乳酸桿菌為主的專性厭氧菌與黏膜上皮表面特異性受體相結(jié)合形成組分相當(dāng)同定的菌膜結(jié)構(gòu)和生物屏障，構(gòu)成腸道定植力，可有效抵御過路菌對(duì)機(jī)體的侵襲。目前已證實(shí)對(duì)胃腸炎具有預(yù)防與治療功效的專利菌株包括LGG，L.rhumnosus 19070-2，L.reuteri DSM 12246，Bifidobuterium Bl）-12 和 L.purucasei ST11等[8-9]。

5.2 降低血脂膽固醇水平的功能

針對(duì)益生菌降低血脂膽固醇水平的機(jī)制，國(guó)內(nèi)外學(xué)者進(jìn)行了廣泛的研究，目前產(chǎn)生了多種不同的假說，包括（1）膽鹽的脫結(jié)合；（2）膽固醇摻入細(xì)胞膜（膽固醇摻入或附著在細(xì)胞上將有可能減少膽固醇由腸道進(jìn)入血液中）；（3）益生菌對(duì)膽固醇的吸收；（4）菌體對(duì)膽固醇的吸附；（5）菌體對(duì)膽固醇的轉(zhuǎn)化（益生菌產(chǎn)生的膽固醇還原酶的作用將膽固醇轉(zhuǎn)化為糞烯醇排出體外從而起到了降低血液中膽固醇含最的作用）等。

目前已申報(bào)具有降低血脂脂膽固醇功能的專利菌株眾多，包括L.ucidophilus RP32}L.uci dophilus ATCC 4962}L.delbrueckii subsp.bulgaricus ATCC 33409 L.plunturum 299V等[10]。

5.3 調(diào)節(jié)血壓的功能

根據(jù)研究表明益生菌的降血壓作用在于其能夠代謝產(chǎn)生蛋白酶，從而降解蛋白質(zhì)，產(chǎn)生ACE活性抑制肽。益生菌代謝產(chǎn)生的蛋白酶，包括肽鏈內(nèi)切酶以及氨基肽酶，在這些酶系的連續(xù)作用下，限制性水解蛋白，主要是酪蛋白，產(chǎn)生分子大小以及作用各有差異的生物活性肽段，其中包括已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的具有抑制ACE活性的小肽，如從啤酒酵母和瑞士乳桿菌中分離的三肽物質(zhì)（Val-Pro-Pro或Ile-Pro-Pro），具有抑制血管緊張素轉(zhuǎn)移酶I活性的作用[11-12]。

此外Saivacla等[13]發(fā)現(xiàn)L.casei細(xì)胞壁成分對(duì)自發(fā)性高壓血大鼠（SHR）和和腎性高血壓大鼠（RHR）具有明顯降壓作用，這種降壓作用呈現(xiàn)出一定的劑量效應(yīng)。以上研究說明益生菌的菌體或其代謝產(chǎn)物都可能具有調(diào)節(jié)血壓的效果。

5.4 具有營(yíng)養(yǎng)功能

目前，有營(yíng)養(yǎng)特性的益生菌主要是芽孢桿菌、其次是雙歧桿菌、乳酸桿菌等[14]。益生菌（如芽孢桿菌）可產(chǎn)生多種揮發(fā)性酸，包括乙酸、丙酸、丁酸等，這些有機(jī)酸能夠降低動(dòng)物腸道的pH，抑制病原菌的生長(zhǎng)，為乳酸菌的生長(zhǎng)提供條件。也有一些益生菌如（雙歧桿菌和乳酸桿菌等）可產(chǎn)生多種機(jī)體所需要的維生素，包括 VB1，VB2，VB6，VB12以及煙酸和葉酸等，使機(jī)體保持正常的生理活動(dòng)。此外部分益生菌可代謝產(chǎn)生人體所需的必需氨基酸、短鏈脂肪酸等，均對(duì)人體骨骼成長(zhǎng)和心臟健康有重要作用。

5.5 刺激免疫系統(tǒng)，提高免疫功能

益生菌對(duì)機(jī)體免疫系統(tǒng)的影響，包括體液免疫調(diào)節(jié)作用，細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)作用及非特異性免疫調(diào)節(jié)作用。

實(shí)驗(yàn)證實(shí)，雙歧桿菌在胃腸道中能夠刺激B淋巴細(xì)胞活化增殖和分泌抗體，來發(fā)揮體液免疫功能。Gately等給小鼠喂短雙歧桿菌發(fā)酵乳，發(fā)現(xiàn)小鼠的腸粘膜下淋巴結(jié)增生，在機(jī)體外實(shí)驗(yàn)中，短雙歧桿菌能夠促進(jìn)小腸粘膜下淋巴結(jié)細(xì)胞增殖。經(jīng)檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，這些淋巴細(xì)胞主要是B淋巴細(xì)胞[15]。

目前人類研究表明，益生菌對(duì)宿主細(xì)胞免疫系統(tǒng)具有正面作用如增強(qiáng)抵抗力。一些益生菌已被證明是使Th1/Th2的平衡傾向于Th1細(xì)胞，這可以解釋它們對(duì)過敏和抵抗力的影響，缺點(diǎn)可能是益生菌可以刺激Th1細(xì)胞介導(dǎo)的疾病（如自身免疫疾?。16]。

此外雙歧桿菌作為機(jī)體消化道內(nèi)的優(yōu)勢(shì)菌群，能夠明顯激活作為機(jī)體天然抵抗力的一個(gè)重要組成部分——吞噬細(xì)胞的活性，進(jìn)而增強(qiáng)機(jī)體的非特異性免疫功能。Guarino等研究發(fā)現(xiàn)，健康人口服兩雙歧桿菌，可以提高粒細(xì)胞和單核白血球的吞噬活性。

益生菌對(duì)免疫抵抗力，接種疫苗的反應(yīng)，過敏性濕疹，和潰瘍性結(jié)腸炎的影響公布的數(shù)據(jù)表明，某些益生菌可能是有效的。然而，需要更多的研究來證實(shí)這一點(diǎn)。

5.6 抗突變抗癌功能

人們發(fā)現(xiàn)，以大鼠和小鼠作為模型，一些雙歧桿菌和乳桿菌在體外具有抗癌和抗腫瘤作用[17]。

人體實(shí)驗(yàn)表明，益生菌可以通過結(jié)合、阻斷或移除來抑制致癌物和前致癌物。還可以對(duì)前致癌物轉(zhuǎn)化為致癌物的細(xì)菌及轉(zhuǎn)化酶的活力進(jìn)行抑制。說的簡(jiǎn)單點(diǎn)，益生菌可以吸附致癌物和對(duì)致癌物質(zhì)進(jìn)行加工或轉(zhuǎn)移，減弱它們的毒性。益生菌能夠幫助身體遠(yuǎn)離有害細(xì)菌和有害的酶，它們就沒有加工致癌物的機(jī)會(huì)了。最典型的例子就是益生菌能降低糞便酶的活力，有效預(yù)防結(jié)腸癌。第二，益生菌能酸化腸道，調(diào)節(jié)腸道菌群，從而減少有害菌的數(shù)量和改變膽汁溶解性。使膽汁減少向致癌物二次膽汁酸的轉(zhuǎn)化。第三，益生菌能促進(jìn)腸道蠕動(dòng)，加快對(duì)糞便中有害的致癌物的排出。

除以上生理功能外益生菌還具有其他功能，包括：①緩解不耐乳糖癥狀；②預(yù)防生殖系統(tǒng)感染；③緩解關(guān)節(jié)炎；④促進(jìn)消化作用；⑤延緩衰老（抗氧化作用）；⑥抑菌作用。

6 益生菌的潛在危害性研究

益生菌的安全性是非常重要的。通過研究益生菌在胃腸道的存活、移位、定居和代謝，可用來評(píng)價(jià)食用益生菌的正面作用和負(fù)面作用。益生菌所帶來的益處很多，但也存在著一些潛在危害，包括：①可能產(chǎn)生條件性感染（如心內(nèi)膜炎和敗血癥等局部或全身性感染）；②可能產(chǎn)生炎癥（超敏反應(yīng)）；③可能產(chǎn)生具有潛在危害性代謝產(chǎn)物和對(duì)機(jī)體有影響的代謝酶（如D型乳酸、氨基脫羧酶和硝基還原酶等）④可能會(huì)轉(zhuǎn)移抗生素基因等[18-19]。

7 分子水平上益生菌研究進(jìn)展

7.1 菌株的分離與鑒定

應(yīng)用分子生物學(xué)的方法，能夠根據(jù)益生菌基因組DNA序列的特異性，進(jìn)行群間、屬間、種間、亞種間、乃至菌株之間的鑒定，幫助從復(fù)雜的培養(yǎng)物中間分離菌株[20]。

鑒定益生菌的分了生物學(xué)方法主要包括PCR技術(shù)、基因組探針技術(shù)、基因組指紋技術(shù)（如RFLPs技術(shù)、RAPD技術(shù)和AFLPs技術(shù)））等[21]。PCR技術(shù)相對(duì)簡(jiǎn)單快速，指利用專一性的引物，分析復(fù)雜菌群的菌種分布情況檢測(cè)染色體上是否存在致病因子的基因，幫助進(jìn)行菌株鑒定。探針技術(shù)與生物芯片技術(shù)結(jié)合，能夠從復(fù)雜微生物環(huán)境中快速檢出并追蹤感興趣的菌株，探針技術(shù)使用的探針包括核糖體寡核苷酸探針（一般是16S rRNA）、全染色體探針、根據(jù)基因組的特殊的序列設(shè)計(jì)的DNA片段、質(zhì)粒DNA探針等?；蚪M指紋技術(shù)利用DNA片段長(zhǎng)度的多態(tài)性，能夠區(qū)分不同的菌株，幫助分析多樣的、動(dòng)態(tài)的微生物菌群[22-23]。

7.2 益生菌基因遺傳修飾

目前基因工程技術(shù)在益生菌研究方面得到了廣泛的應(yīng)用，包括：構(gòu)建能合成有用的特殊營(yíng)養(yǎng)成分的益生菌菌株、構(gòu)建能產(chǎn)生動(dòng)物生理性缺乏的物質(zhì)的益生菌株、利用基因工程技術(shù)生產(chǎn)抗耐性菌株以及提高定植和黏附力益生菌等[24]。

呂道俊等采用PCR方法擴(kuò)增，對(duì)益生芽抱桿菌進(jìn)行遺傳改造，得到了地衣芽抱桿菌天門冬氨酸激酶基因，為研制既有益生功能，又可以在體內(nèi)直接產(chǎn)生供機(jī)體需要的氨基酸等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的多功能基因工程益生菌提供了基礎(chǔ)。此外利用益生菌作為體內(nèi)生物反應(yīng)器，可以表達(dá)外源基因主要包括酶基因和抗病基因，對(duì)促進(jìn)消化的外源激素、酶基因的克隆和表達(dá)的報(bào)道也比較多?？梢娨嫔鳛榛蚬こ淌荏w菌的應(yīng)用前景十分廣闊。

8 展望

隨著益生菌產(chǎn)品的不斷壯大，益生菌的研究工作還需要進(jìn)一步深入，亟待研究的領(lǐng)域總結(jié)如下：①通過直接對(duì)人進(jìn)行口服益生菌產(chǎn)品等試驗(yàn)，確定益生菌的生理學(xué)功能、作用機(jī)理及其產(chǎn)生的影響程度。②益生菌的功能評(píng)價(jià)，特別是對(duì)免疫系統(tǒng)、癌癥和腸道微生態(tài)的調(diào)節(jié)功能。③評(píng)價(jià)益生菌對(duì)腸道微生物的數(shù)量和活性的影響，基因重組技術(shù)在這一領(lǐng)域有較大的應(yīng)用潛能。④確立載體對(duì)益生菌的影響。⑤提高益生菌分類的可靠性并使之易于分類，提高菌株的性能和活性。

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