BCL-2家族在缺血性腦血管病中的抗凋亡作用

杜圓圓1綜述，羅永杰2△審校

(1.瀘州醫(yī)學(xué)院，四川瀘州646000;2.四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，四川成都610072)

BCL-2家族在缺血性腦血管病中的抗凋亡作用

杜圓圓1綜述，羅永杰2△審校

(1.瀘州醫(yī)學(xué)院，四川瀘州646000;2.四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，四川成都610072)

目前由于腦缺血的高發(fā)病率、高死亡率，許多學(xué)者對其進(jìn)行深入研究，發(fā)現(xiàn)腦缺血后神經(jīng)損傷中除壞死外，還存在神經(jīng)元凋亡現(xiàn)象。細(xì)胞凋亡是由基因調(diào)控的細(xì)胞主動死亡過程，神經(jīng)元死亡分為兩個階段，其第二階段為遲發(fā)性死亡(delayed neuronal death，DND)，即在腦缺血中，神經(jīng)細(xì)胞在再灌注后數(shù)小時甚至數(shù)天后才發(fā)生死亡。Bcl-2家族蛋白在細(xì)胞凋亡過程中具有重要的調(diào)控作用，其抗凋亡蛋白成員和促凋亡蛋白成員之間的協(xié)同作用，共同決定細(xì)胞是否進(jìn)入凋亡程序。其表達(dá)的變化對細(xì)胞的命運起決定作用。

腦缺血;BCL-2家族;凋亡

1 Bcl-2家族蛋白質(zhì)的一般特性

1.1 Bcl-2家族成員及其分類Bcl-2家族分為三個亞族:原生存亞族(pro-survival subfamily)即Bcl-2亞族，成員有Bcl-2、Bcl-Xl、KS-Bel-2、Bcl-w、Mcl-1、BHRF1、NR-13、ORFl6、LMW5-HL、AI、EIB-19K及CED-9;兩個原凋亡亞族(proapoptotic subfamily)是Bax和BH3亞族。Bax、Bak及Bok屬于Bax亞族，Bik、Blk、Hrk、BNIP3、Bim、Bad、Bid及EGL-l屬BH3亞族［4］。其中15種蛋白為哺乳動物(主要是人)所有，NR-13為雞類所有，線蟲C.elegans中的蛋白有CED-9及EGL-l，病毒蛋白有LMW5-HL、BHRFl、ORF-16、KS-Bcl-2和EIB-19K。

1.2 Bcl-2相關(guān)蛋白結(jié)構(gòu)Bcl-2基因是B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2的縮寫，Tsujimoto等［5］于1984年從濾泡性淋巴瘤和白血病細(xì)胞中分離出來的一種原癌基因。正常情況下，Bcl-2基因位于18q21，含有3個外顯子和2個開放閱讀框架(啟動子)。第一個外顯子不翻譯，蛋白編碼區(qū)為外顯子2、3?；蚪MDNA的外顯子2被一個＞50 kb的內(nèi)含子隔成兩部分，轉(zhuǎn)錄時這一內(nèi)含子序列被剪切掉。Bcl-2基因轉(zhuǎn)錄6.0 kb的mRNA，經(jīng)不同拼接，翻譯為由239個氨基酸殘基組成、分子量為26kd的Bcl-2a和21kd的Bcl-2B兩種相似的蛋白。其結(jié)構(gòu)特點是在梭基端有一個由19個疏水氨基酸組成的疏水性片段，能使Bcl-2蛋白插入膜結(jié)構(gòu)中，并有多個高度保守功能片段:S-N，SⅡ/SⅡ-C，BH1和BH2。免疫組化及共聚焦顯微鏡、激光掃描顯微鏡和電子顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，Bcl-2蛋白位于核膜、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體膜上［6～8］。Bcl-2基因是一種強(qiáng)有力的細(xì)胞死亡抑制因子，其成員在細(xì)胞凋亡中的作用分為兩類:一類為抗凋亡蛋白，包括Bcl-2、Bcl-xL、Bcl-w等;另一類為促凋亡蛋白，包括Bax、Bak、Bid等。Bcl-2家系的成員均由1-4個Bcl-2同源區(qū)域(Bcl-2 homology domain，BH)構(gòu)成，BH1-BH4均具有α螺旋結(jié)構(gòu)。到目前為止，發(fā)現(xiàn)所有抗凋亡因子均具有BH1到BH4 4個同源區(qū)域，而促凋亡因子均缺乏第一個α螺旋片段—BH4區(qū)域［9，10］。BH3區(qū)域?qū)τ诖俚蛲鲆蜃觼碚f似乎是最重要的功能區(qū)，因為目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)促凋亡因子Bid、Bad和Bim等只有BH3區(qū)。另外，許多Bcl-2成員羧基端存在一個疏水區(qū)域(carboxy-terminal hydrophobic，TM)，它決定了Bcl-2家族蛋白的生物膜靶向性［11］。家族各成員之間可以形成同源或異源二聚體，抗凋亡蛋白成員和促凋亡蛋白成員之間的協(xié)同作用，共同決定細(xì)胞是否進(jìn)人凋亡程序。

1.3 Bcl-2的生物功能Bcl-2基因在許多胚胎組織中廣泛表達(dá)［12］，但在成體組織中，Bcl-2似乎在迅速分裂并分化的細(xì)胞中表達(dá)，這類細(xì)胞包括腸上皮或皮膚隱窩的干細(xì)胞以及造血祖細(xì)胞。在成熟的細(xì)胞或處于將被消除的階段的細(xì)胞中，bcl-2的表達(dá)下降。例如在角質(zhì)化細(xì)胞或髓細(xì)胞分化過程以及在B和T細(xì)胞分化過程中，當(dāng)這些細(xì)胞即將通過凋亡而發(fā)生克隆性消亡時，Bc1-2均下調(diào)。有人據(jù)此假設(shè)Bcl-2是早期始祖細(xì)胞或長壽命的已充分分化的細(xì)胞的存活因子。另一方面，在組織分化過程中。Bcl-2的下調(diào)似乎促進(jìn)在克隆選擇期間發(fā)生的或者與上皮或造血細(xì)胞的終未分化相關(guān)的細(xì)胞死亡。Bcl-2蛋白的生理功能主要是抑制細(xì)胞凋亡，延長細(xì)胞壽命，而不影響細(xì)胞周期和分化進(jìn)程，這對于維持體內(nèi)某些需長期生存的細(xì)胞如神經(jīng)元、免疫記憶細(xì)胞、造血干細(xì)胞等的壽命具有重要意義［13］。

2 Bcl-2抗凋亡作用機(jī)理

Bcl-2蛋白定位于線粒體膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜和核膜上，具有離子通道和?？康鞍椎碾p重功能，它在介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的途徑中起關(guān)鍵作用。線粒體在細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮非常重要的作用，Bcl-2蛋白在線粒體膜上從三個方面抑制細(xì)胞凋亡:①Bcl-2能改變線粒體巰基的氧化還原狀態(tài)來控制其膜電位從而調(diào)控細(xì)胞凋亡。在細(xì)胞凋亡中，線粒體的巰基可能組成了胞內(nèi)氧化還原電位的傳感器，Bcl-2可能是通過抑制谷胱甘肽(GSH)的外泄，降低胞內(nèi)的氧化還原電位，來抑制細(xì)胞凋亡的;②Bcl-2能調(diào)節(jié)線粒體膜對一些凋亡蛋白前體的通透性。Bcl-2蛋白可能是線粒體PT孔道的組成成分，它在較高pH的條件下能形成離子通道，而Bax則能在較為廣泛的pH范圍內(nèi)形成孔道。Bax能允許一些離子和小分子如細(xì)胞色素c等穿過線粒體膜，進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，從而引起細(xì)胞凋亡，而Bcl-2的作用正好相反，它能封閉Bax形成孔道的活性，使一些小分子不能自由通透，從而保護(hù)細(xì)胞凋亡;最新研究認(rèn)為，細(xì)胞質(zhì)存在誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子，可介導(dǎo)細(xì)胞質(zhì)基因表達(dá)來調(diào)節(jié)細(xì)胞的生存［14］。③bcl-2能將凋亡蛋白前體Apaf-1等定位至線粒體膜上，使其不能發(fā)揮凋亡作用。實驗證明，盡管Bcl-2與胱冬肽酶之間無親和力存在，但當(dāng)二者在細(xì)胞中同時表達(dá)時卻發(fā)現(xiàn)它們之間有相互作用。這種作用可能是間接的，是通過第三者CED-4來實現(xiàn)的。Bcl-2能與線蟲中的CED-4結(jié)合并抑制其功能，而Apaf-1具有與胱冬肽酶結(jié)合的功能域，能參與細(xì)胞色素c依賴的胱冬肽酶激活。這表明Apaf-1就象線蟲中CED-4一樣，一方面能激活胱冬肽酶引起凋亡;另一方面又作為接頭蛋白能把Bcl-2相關(guān)蛋白與胱冬肽酶聚集在一起，并使胱冬肽酶失活，從而保護(hù)細(xì)胞凋亡［15］。其次，Bcl-2蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上也發(fā)揮著重要作用，通過調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+參與的核內(nèi)外物質(zhì)轉(zhuǎn)運及膜通透性轉(zhuǎn)換(PT)來阻止細(xì)胞色素C從線粒體中釋放，達(dá)到阻止細(xì)胞凋亡的級聯(lián)反應(yīng)過程［16、17］，從而阻斷細(xì)胞凋亡。

3 腦缺血后Bcl-2家族的表達(dá)及意義

缺血性腦血管病的發(fā)病機(jī)制包括能量耗竭、酸中毒、興奮性氨基酸毒性作用，細(xì)胞內(nèi)鈣超載、氧自由基、炎癥細(xì)胞因子介入、細(xì)胞凋亡等多個方面［18］。腦缺血程度決定細(xì)胞死亡方式，嚴(yán)重缺血引起細(xì)胞能量耗竭，細(xì)胞內(nèi)鈉、鈣升高導(dǎo)致細(xì)胞壞死，輕微缺血及再灌注損傷則易觸發(fā)凋亡［18］。腦缺血后，神經(jīng)元壞死與凋亡并存，細(xì)胞壞死位于缺血中心區(qū)，細(xì)胞凋亡主要出現(xiàn)在缺血周邊區(qū);而在腦缺血的遲發(fā)性神經(jīng)元死亡期，則以細(xì)胞凋亡為主。凋亡可能決定了最終梗死體積。研究表明，Bcl-2基因是腦缺血神經(jīng)元凋亡調(diào)控基因的重要組成部分。Bcl-2的過度表達(dá)能明顯抑制缺氧所介導(dǎo)的神經(jīng)元死亡［19］，其參與神經(jīng)細(xì)胞的分化發(fā)育調(diào)節(jié)，并且可以促進(jìn)視神經(jīng)節(jié)細(xì)胞軸突的生長和再生。通過基因敲除、轉(zhuǎn)基因動物和基因轉(zhuǎn)染等實驗發(fā)現(xiàn)，具有明顯的抑制細(xì)胞凋亡作用和神經(jīng)保護(hù)作用。shimazaki等［20］研究短暫性缺血后沙土鼠海馬中Bcl-2蛋白表達(dá)發(fā)現(xiàn)，在缺血2分鐘后，海馬CAI區(qū)Bcl-2蛋白的免疫反應(yīng)活性增加，誘導(dǎo)了對繼發(fā)性缺血的耐受性，并阻止了遲發(fā)性神經(jīng)元死亡;然而缺血5分鐘，Bcl-2蛋白免疫反應(yīng)活性下降，在海馬CAI區(qū)可出現(xiàn)神經(jīng)元死亡。但是，先用缺血2分鐘處理后恢復(fù)血流，再繼發(fā)缺血5分鐘，則可阻止第2次缺血后遲發(fā)性神經(jīng)元死亡，從而認(rèn)為短暫性缺血后海馬CAI區(qū)獲得的對遲發(fā)性神經(jīng)元死亡的抑制與Bcl-2蛋白有密切的關(guān)系。Chen等［21］對大鼠缺血60 min及120 min后再灌流24小時Bcl-2表達(dá)進(jìn)行了觀察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)缺血60 min組在大腦皮層可有Bcl-2蛋白表達(dá)，缺血120 min組，可發(fā)現(xiàn)小膠質(zhì)細(xì)胞，內(nèi)皮細(xì)胞和血管壁均有表達(dá)，這說明腦缺血中沒有受到致命損傷細(xì)胞可誘導(dǎo)Bcl-2表達(dá)。而Bcl-2只表達(dá)在肯定能存活的神經(jīng)元上。Bcl-2表達(dá)的上調(diào)也許反映了一種保護(hù)神經(jīng)元積極生存的機(jī)制。

在研究Bcl-2蛋白及其作用機(jī)制時，發(fā)現(xiàn)一種相對分子質(zhì)量為21 000的蛋白，命名為Bax;bax基因5'非翻譯區(qū)有4個p53結(jié)合位點，編碼區(qū)含有Bcl-2蛋白高度同源的BHI和BHZ結(jié)構(gòu)域，是bax自身和Bcl-2家族其他成員形成同型或異型二聚體，促進(jìn)細(xì)胞凋亡［22］。Krajewski等［23］在全腦缺血再灌流模型著重觀察了bax蛋白變化。他們發(fā)現(xiàn)全腦缺血10 min后再灌流0.5～3小時時，各腦區(qū)神經(jīng)細(xì)胞逐漸呈變性改變，bax免疫染色明顯增強(qiáng)。利用雙標(biāo)法同步分析bax蛋白和原位DNA片段在缺血細(xì)胞中的變化，發(fā)現(xiàn)進(jìn)行凋亡的神經(jīng)元bax蛋白免疫呈高表達(dá)，主要存在于海馬CA1區(qū)及小腦purkinje細(xì)胞。他們也發(fā)現(xiàn)變性神經(jīng)元Bcl-2免疫反應(yīng)下降，尤其是Bcl-x，因此他們認(rèn)為Bcl-2家族某些基因決定DND的發(fā)生。Sermadias等［24］認(rèn)為Bax不僅能和Bcl-2形成二聚體抑制凋亡，而且其自身還能形成二聚體誘導(dǎo)凋亡，Bax蛋白過度表達(dá)時bax同源二聚體增多，對誘導(dǎo)凋亡的刺激因素更加敏感。bax有對抗hcl-2，促進(jìn)凋亡的功能。并有研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)這兩種蛋白之間的動態(tài)關(guān)系可以用Bcl-2/Bax比率來表示，而Bcl-2/Bax比率的高與低可能決定細(xì)胞在受到凋亡刺激信號后是趨向于存活或死亡，即Bcl-2/Bax＞1時，對細(xì)胞凋亡起抑制作用，細(xì)胞趨于存活;Bcl-2/Bax＜1時，對細(xì)胞凋亡起促進(jìn)作用，細(xì)胞趨于死亡［25～27］。

4 展望

細(xì)胞凋亡是缺血性腦損傷中細(xì)胞死亡的途徑之一，而Bcl-2家族蛋白在其不同成員相互協(xié)同作用下，發(fā)揮抗凋亡或促凋亡作用。在腦缺血損傷早期采用轉(zhuǎn)基因、HSV載體或其他新的病毒載體、以及神經(jīng)保護(hù)劑如IL-8單克隆抗體［28］等積極的方法，增加Bcl-2等抗凋亡基因的表達(dá)，有可能成為今后臨床治療缺血性腦血管病的一個新方法。此外，Bcl-2基因在某些情況下并不能阻止細(xì)胞凋亡，如不能阻止腫瘤壞死因子(TNF)等介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，這也揭示細(xì)胞凋亡的復(fù)雜的分子機(jī)制，還需進(jìn)一步研究。

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Anti-apoptotic effects of BCL-2 family in ischemic cerebrovascular disease

DU Yuan-yuan，LUO Yong-jie

R743.31;R329.25

B

1672-6170(2012)05-0219-04

2012-04-21;

2012-05-21)

△通訊作者，碩士生導(dǎo)師