徐 龍,梁蕊芳,靳 燁
(1.內蒙古農業(yè)大學食品科學與工程學院,內蒙古呼和浩特010018;2.包頭輕工職業(yè)技術學院生物工程系,內蒙古包頭010040)
肉制品中亞硝酸還原酶的應用進展
徐 龍1,2,梁蕊芳2,靳 燁1,*
(1.內蒙古農業(yè)大學食品科學與工程學院,內蒙古呼和浩特010018;2.包頭輕工職業(yè)技術學院生物工程系,內蒙古包頭010040)
亞硝酸還原酶(nitrite reductase,NIR)是陸地上氮元素循環(huán)過程中降解亞硝酸鹽的一個關鍵酶,能把亞硝酸鹽還原生成NO或NH4+。綜述了國內外研究者從不同方面對NIR的研究,論述了NIR的組成結構、工作機理及反應特性,總結了產NIR菌株及NIR在肉制品中的應用,并對NIR的研究及應用進行了展望。
亞硝酸還原酶,脫硝細菌,亞硝酸鹽
亞硝酸還原酶(nitrite reductase,簡稱NIR)是陸地上氮元素循環(huán)過程中的一種酶,是一種降解亞硝酸鹽的關鍵酶。NIR分為兩類,分別含有血紅素cd1和Cu作為輔基(相應簡稱為cd1NIR、CuNIR)。它們有異化亞硝酸還原酶或同化亞硝酸還原酶的作用,把亞硝酸鹽還原生成NO或NH4+。微生物的反硝化作用在全球氮循環(huán)過程中起著重要作用,特別是在環(huán)境凈化方面有著舉足輕重的作用?,F在公認的反硝化過程分為4步,分別由不同的還原酶催化,其中NO2-轉變成NO由NIR所催化,其催化反應為:NO2-+e-+2H+→NO+H2O;在一般田間條件下,NO3-是植物吸收的主要形式,當NO3-被細胞吸收后,細胞質中的硝酸還原酶就利用NADH供氫體將NO3-還原為NO2-,NO2-被運到葉綠體,葉綠體內存在的NIR利用光合鏈提供的還原型Fd作電子供體將NO2-還原為NH4+[3-6],其催化反應為:NO2-+8H++6e-→NH4++2H2O(E0=+0.34V)。
1996年Calmels S等通過對脫硝細菌(Pseudomonas aeruginosa)的生物化學和免疫學研究,表明cd1NIR是催化亞硝化反應生成NO的限速酶[7]。Roger L等研究發(fā)現脫硝細菌(Alcaligenes xylosoxidans)能合成天青蛋白,天青蛋白能夠在體外作為CuNIR的電子供體,在亞硝酸鹽的環(huán)境下,標記天青蛋白的基因azuA增加[8],可見在亞硝酸環(huán)境下CuNIR的電子供體增加,從而提高CuNIR降解亞硝酸鹽的性能。然而,NIR并非都具有降解亞硝酸的功能,Pereira I.A.C等在不耐硝酸鹽的硫酸鹽還原細菌(Desulfovibrio vulgaris Hildenborough)中提取出NIR,通過電子順磁共振(EPR)發(fā)現D.vulgaris Hildenborough不具有用亞硝酸鹽作為末端電子接受者的功能,表明NIR在該菌中與亞硝酸鹽降解無關,不同于其他菌中提取出的NIR[9]。
CuNIR的功能單位是同型三聚體,亞基分子量37ku[10],共含有六個銅原子。銅原子又分為兩類:類型Ⅰ的銅(T1Cu)被包埋在每個單體中,距分子表面約4?,是電子傳遞中心;類型Ⅱ的銅(T2Cu)則被結合在兩個單體之間,位于一個約12?深的溶劑通道底部,是催化中心[11]。來源于糞產堿菌(Alcaligenes faecalis)的NIR的單體含有兩個β螺旋結構域,T1Cu植入其中一個螺旋,由配體His 95、Cys 136、His 145和Met 150協(xié)同;T2Cu位于兩個單體的接觸面,由一個水分子和三個組氨酸協(xié)同。
cd1NIR是一個雙功能團酶,催化亞硝酸鹽減少一個電子生成NO,雙氧減少四個電子生成水,是同型二聚體,亞基分子量為60ku,每個亞基包含一個血紅素C和一個血紅素d1,該酶位于細菌的周質中。1995年Fulop等和1997年Nurizzo等分別從副球菌屬(Paracoccus pantotrophus)和綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa)測出NIR的高分辨率結構,兩個來源的NIR的血紅素C以共價鍵結合于N端α螺旋結構域,血紅素d1以非共價鍵結合于C端β螺旋結構域[12]。
酶的三維空間結構與其催化活性和調節(jié)作用緊密相關,而酶蛋白分子中與底物結合并起催化作用的區(qū)域,作為酶的活性中心,是酶起催化作用的關鍵部位。CuNIR還原NO2-的步驟包括NO2-與酶的結合、還原反應、結合的中間產物脫水以及NO的釋放和酶的重新形成。對于CuNIR的催化機理,最近的模型認為NO2-結合到氧化形式的T2Cu中心,取代一個可溶性分子并在NO2-的一個氧原子和Asp98殘基間形成氫鍵。當電子從T1Cu中心傳遞到T2Cu中心后,該氫鍵的質子從Asp98殘基轉移到底物的氧原子上形成中間產物O=N-O-H,該氧原子的N-O鍵隨后斷裂并形成產物NO,然后在活性中心被釋放[3]。
對于cd1NIR工作機理的研究,則集中在電子供體方面。1978年Chippaux M等人發(fā)現,完整的E.coli細胞用葡萄糖或甲酸鹽做電子供體,能夠減少亞硝酸鹽。在含有亞硝酸鹽的環(huán)境中,細胞中含有少量的C型細胞色素C552,當去除細胞色素C552時,亞硝酸還原酶失去90%的活性,從而認為這種細胞色素能被亞硝酸鹽重復氧化,來減少亞硝酸[13]。但隨著研究的深入,人們發(fā)現細胞色素C是作為酶的電子供體在起作用。如1995年Williams等人發(fā)現,互不相關的天青蛋白、假天青蛋白、細胞色素C550和細胞色素C551作為cd1NIR的電子供體[14]。2003年Person等人通過Paracoccus denitrificans的基因刪除實驗確定假天青蛋白和細胞色素C550可在體外作cd1NIR的電子供體[15]。
2002年張慶芳等對乳酸菌降解亞硝酸鹽機理進行了研究,認為乳酸菌對亞硝酸鹽的降解分為酶降解和酸降解兩個階段。在發(fā)酵的前期,培養(yǎng)液pH>4.5時,乳酸菌對亞硝酸鹽降解以酶降解為主;發(fā)酵后期,由于乳酸菌本身產生酸,使培養(yǎng)液pH降低,pH< 4.0后,亞硝酸鹽的降解以酸降解為主[16]。
到目前為止,國外對亞硝酸鹽還原酶的分離純化、基因的表達和調控,特別是植物亞硝酸還原酶基因的表達和調控、結構研究有諸多報道,并從多種微生物中分離純化得到亞硝酸還原酶[17-19]。由于大多數酶都是蛋白質,具有蛋白質的結構和生物學特性,因此,酶需要在適宜的溫度、壓力、酸堿等物理和化學條件下才具有催化活性。并且,酶的活性受到酶源活化、激活劑和抑制劑的作用、激素調節(jié)等各種方式的調節(jié)和控制。1970年Solov’ev VI等用超聲破碎和高速離心從無色桿菌(Achromobacter guttatus)中分離獲得亞硝酸還原酶,對該酶的酶學特性進行研究,發(fā)現該酶最適反應條件為pH7.4,30~40℃,還原型NADP和FAD增加酶活,主要反硝化產物為NO[20]。1973年Pfeil E等研究微球菌活菌及粗酶的亞硝酸鹽還原酶的活性,結果表明,亞硝酸鹽還原酶的活性依賴于pH(適宜pH6.7)并需要NADH,酶活性在pH低于5時急速下降,表明該酶是嚴格pH依賴酶,并在低pH時抑制NADH合成[21]。1978年,Eiko Sawada等人從紅假單胞菌(Rhodopseudomonas sphaeroides)中分離出NIR,其亞硝酸鹽耐受力為51μmol/L,最適pH為7.0,最適溫度為30℃。該酶被CO、氰化鉀和二乙基二硫氨基甲酸酯抑制,被甲碘醋酸鹽活化[22]。
NIR是一種誘導酶,是在環(huán)境中有亞硝酸鹽存在的情況下,誘導而生成的酶。1999年Neubauer H通過研究肉糖葡萄球菌(Staphylococcus carnosus)中亞硝酸還原系統(tǒng)的分子特性表明,厭氧和亞硝酸鹽是NIR的誘導因素,盡管檢測到轉錄,但在亞硝酸鹽存在時細胞在好氧條件下未表現出亞硝酸還原,表明在轉錄水平上存在額外氧控制步驟,亞硝酸還原酶在厭氧條件下表達,但在氧增加時快速消失,很有可能是由于在好氧呼吸鏈競爭了電子[23]。然而,2007年Giovanni等研究發(fā)現,一種酵母Debaryomyces hansenii TOB-Y7能夠在純化學合成培養(yǎng)基中、在微需氧條件下利用亞硝酸鹽作為唯一氮源,降解亞硝酸鹽的能力伴隨編碼亞硝酸還原酶的YNI1基因表達,并且添加電子傳遞體NAD(P)H有助于亞硝酸還原酶的產生[24]??梢?,NIR的合成除取決于誘導物以外,還取決于細菌所處的環(huán)境和細胞內所含的基因。如果細胞內沒有控制某種酶合成的基因和處于適合的環(huán)境,即便有誘導物存在也不能合成這種酶。因此,誘導酶的合成取決于內因和外因兩個方面。誘導酶在微生物需要時合成,不需要時就停止合成。這樣,既保證了代謝的需要,又避免了不必要的浪費,增強了微生物對環(huán)境的適應能力。
隨著肉類加工技術的不斷提高,微生物發(fā)酵肉制品的研究不斷深入,乳酸菌在肉制品中的應用日益廣泛。乳酸菌具有降解亞硝酸鹽的特性,利用乳酸菌降解亞硝酸鹽具有安全可靠、反應溫和的優(yōu)點。李春等通過對乳酸菌混合生長降解亞硝酸鹽能力的研究得出,乳酸菌高效降解亞硝酸鹽能力是通過乳酸菌產亞硝酸鹽還原酶的能力和產生乳酸能力共同影響的[25]。在pH4.5以上以酶降解為主,在pH<4時以酸降解為主[16]。
乳酸菌在肉制品中的應用主要是用于發(fā)酵香腸,隨著人們對乳酸菌研究的不斷深入,其在肉制品中的亞硝酸鹽降解能力也成為研究的一個方面。2004年張慶芳等人的研究表明,短乳桿菌(Lactobacillus brevis)有較強去除亞硝酸鹽的能力,亞硝酸鹽含量在250mg/L以內,接種短乳桿菌48h亞硝酸鹽全部去除。亞硝酸鹽含量在200mg/L以內,短乳桿菌對亞硝酸鹽的去除量與底物濃度有極顯著的線性關系[26]。2008年,李長青等利用乳酸菌發(fā)酵生產低硝牛肉香腸,其理化指標、微生物指標、感官指標等均優(yōu)于傳統(tǒng)的牛肉香腸,且香腸中亞硝酸鹽的殘留量低于傳統(tǒng)牛肉香腸[27]。蔣欣茵等從多種傳統(tǒng)腌制蔬菜中分離到12株乳酸菌,最終篩選出1株能快速降解亞硝酸鹽的植物乳桿菌J-10,該菌24h亞硝酸鹽降解率為99.2%[28]。夏巖石等研究了乳酸菌Lact.1對不同濃度亞硝酸鹽的降解能力以及不同溫度下乳酸菌Lact.1純培養(yǎng)液降解亞硝酸鹽的動態(tài)變化,結果表明,一定接種量的乳酸菌Lact.1純培養(yǎng)液能有效降解亞硝酸鹽,其降解亞硝酸鹽的最佳濃度為320mg/kg,最適溫度為37℃[29]。王昌祿等從發(fā)酵初期的天津冬菜中分離到1株乳酸菌,初步鑒定其為腸膜明串珠菌(Leuoconostoc mesenteroieds)W-58,該株菌對亞硝酸鹽有明顯的降解作用,通過研究溫度和底物濃度與分離菌株去除亞硝酸鹽量的關系,表明W-58菌株對亞硝酸鹽的降解主要為產酶降解[30]。2009年,龔鋼明等通過測定乳酸菌其在MRS液體培養(yǎng)基中降解亞硝酸鹽的能力,篩選出降解亞硝酸鹽能力較高的菌株,對亞硝酸鹽的最適耐受濃度為0~0.4g/L[31]。
目前,酶在肉制品加工中主要用來嫩化肉類、增加持水力以及肉的重組。NIR在肉制品中降解亞硝酸鹽降低其殘留的研究,無疑是給酶在肉制品中的應用拓展了一個新領域。1970年Solov’ev VI等研究在香腸加工中應用亞硝酸還原酶降低亞硝酸鹽殘留,結果表明,應用亞硝酸還原酶在煮熟香腸中,亞硝酸鹽殘留降低至原來的30%~40%,但其結果依賴于亞硝酸還原酶酶學特性,因為該酶高于50℃后酶活完全損失,亞硝酸鹽的殘留不能完全控制[20]。2007年Jacob Gotterup等人對腌肉中葡萄球菌的硝酸鹽還原酶和亞硝酸鹽還原酶的活性與亞硝基肌紅蛋白(MbFeIINO)之間的關系進行了研究,結果表明,只具有硝酸還原酶活性的產生MbFeIINO,而亞硝酸還原酶與MbFeIINO的生成率并沒有聯系。但該研究沒有研究亞硝酸還原酶與亞硝酸鹽殘留的關系[32]。2006年Tamara V.Tikhonova等人從嗜鹽堿硫氧化非氨化細菌中(Thioalkalivibrio nitratireducens)分離和提純到電泳均一性高活性的NIR,該酶能催化減少亞硝酸和羥胺生成氨,而沒有其他中間產物[33]。2009年鄭懷忠通過紫外線對巨大芽孢桿菌MPF-906進行了誘變處理,提高了產酶能力,并優(yōu)化培養(yǎng)基條件使亞硝酸還原酶的酶活達到45.94U/mL;將其應用在蒸煮香腸中測出亞硝酸殘留量為15.84mg/kg,大大低于國標要求的<30mg/kg,與對照相比,降解了82.50%[34]。雖然早在1970年就有NIR在肉制品中應用的研究,但到目前為止相關的研究非常有限,且僅局限于亞硝酸鹽降解的研究,缺少酶對肉制品的質構、色澤、儲存、營養(yǎng)變化及安全性等方面的研究。
亞硝酸鹽是一種重要的食品添加劑,但其過量使用會給人體帶來很大危害,所以世界上許多國家呼吁嚴格控制亞硝酸或硝酸鹽使用量,研究利用可降解亞硝酸鹽的微生物或其產生的亞硝酸還原酶,采用生物處理的方法,來降低食品中亞硝酸鹽含量,應是一個可行的研究方向。但是,國外對NIR在肉制品中應用的研究幾乎沒有,僅集中在能產生NIR的菌種在發(fā)酵香腸中的應用效果。國內的研究雖然涉及到了NIR在肉制品中的應用,但目前只研究到粗酶的應用效果,而對NIR的精酶的提取、NIR的晶體結構、NIR的固定化及其應用涉足不深,并缺少從分子水平對產NIR菌種和NIR降解亞硝酸鹽機理的研究。可見,NIR對亞硝酸鹽降解的研究還具有很大的空間和實際應用價值。
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Research progress in nitrite reductase in meat products
XU Long1,2,LIANG Rui-fang2,JIN Ye1,*
(1.College of Food Science and Engineering of Inner Mongolia Agricultural University,Hohhot 010018,China;
2.Bioengineering Department of Baotou Light Industry Vocational Technical College,Baotou 010040,China)
Nitrite reductase(NIR)reduces nitrite to NO or NH4+,this is a key step in the nitrogen cycle.The advances in study on NIR,including the structure,catalysis mechanism and the response characteristic were reviewed.Application of NIR and denitrifying bacteria in meat products were summarized.Application and research prospects of NIR in the future were also presented.
nitrite reductase;denitrifying bacteria;nitrite
TS251.1
A
1002-0306(2012)03-0413-04
亞硝酸鹽能夠作為食品添加劑,在肉制品加工中被廣泛使用,原因在于亞硝酸鹽與肌紅蛋白反應生成亞硝基肌紅蛋白,使肉制品具有誘人的玫瑰紅色澤;亞硝酸鹽可以有效抑制肉毒梭狀芽孢桿菌的繁殖,起到防腐作用;亞硝酸鹽可以使肉制品具有彈性,口感良好,產生獨特的風味,提高產品品質。世界衛(wèi)生組織規(guī)定每日允許攝食量為亞硝酸鉀或鈉≤0.2mg/kg體重,日本規(guī)定肉制品中亞硝酸根不得超過70ppm,我國要求肉制品成品中的亞硝酸含量≤30mg/kg,最大添加量不能超過0.15g/kg。但是,亞硝酸鹽殘留對人有極大的危害,它能與各種氨基化合物反應,產生致癌的N-亞硝基化合物,如亞硝胺等[1]。因此有人提出在肉制品中少加甚至不加入亞硝酸鹽,為此,科學工作者們在降低亞硝酸鹽的添加量與尋找有效的替代物方面正展開積極的研究。隨著生物技術的發(fā)展,利用可產生亞硝酸鹽還原酶降解亞硝酸鹽的微生物或者其產生的亞硝酸鹽還原酶來降低肉制品中亞硝酸鹽含量[2],已經成為一個新的研究方向。
2010-09-19 *通訊聯系人
徐龍(1977-),男,博士,農藝師,研究方向:農產品加工與儲藏工程。