紅衣組分對(duì)花生分離蛋白及其酶解產(chǎn)物理化和抗氧化性質(zhì)的影響

顧 煒，楊曉泉，*，劉遠(yuǎn)洋，郭 健，任曉鳴

（1.華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院，食物蛋白工程研究中心，廣東廣州510640；2.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江大慶163319）

紅衣組分對(duì)花生分離蛋白及其酶解產(chǎn)物理化和抗氧化性質(zhì)的影響

顧 煒1，楊曉泉1，*，劉遠(yuǎn)洋2，郭 健1，任曉鳴1

（1.華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院，食物蛋白工程研究中心，廣東廣州510640；2.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江大慶163319）

以花生為原料，研究了花生紅衣組分對(duì)花生分離蛋白及其酶解產(chǎn)物理化和抗氧化性質(zhì)的影響。研究結(jié)果表明：含紅衣的分離蛋白酶解速度低于不含紅衣的；相同水解度條件下，含紅衣的表面疏水性小于脫紅衣的；GPC分布中，含紅衣的峰值大于脫紅衣的；紅衣組分能夠提高花生分離蛋白及其酶解產(chǎn)物的溶解性、乳化穩(wěn)定性、乳化活性；在相同水解度條件下，含紅衣的水解產(chǎn)物多酚含量顯著高于脫紅衣的，多酚含量的差異與花生分離蛋白及其水解產(chǎn)物的抗氧化性具有正相關(guān)性。

紅衣，花生分離蛋白，水解產(chǎn)物，理化性質(zhì)，抗氧化活性

花生粕作為花生加工的副產(chǎn)物，在我國(guó)產(chǎn)量較為豐富，每年在花生榨油后，可得到約125萬(wàn)t的花生粕[1]，花生粕含蛋白質(zhì)40%以上[2]，在植物蛋白資源中，花生蛋白居第三位，占蛋白總量的11%，是較理想食用蛋白資源[3]。多酚類物質(zhì)廣泛存在于植物體內(nèi)，對(duì)植物蛋白的理化、營(yíng)養(yǎng)及結(jié)構(gòu)性質(zhì)有著不容忽視的影響。國(guó)外文獻(xiàn)報(bào)道，多酚類物質(zhì)能夠提高蛋白的溶解性[4]、乳化性和起泡性[5]、熱穩(wěn)定性[6]；多酚類物質(zhì)能夠提高蛋白的抗氧化性[7]，因此，系統(tǒng)地比較研究多酚對(duì)蛋白各方面性質(zhì)的影響，對(duì)于植物蛋白改性、深加工都有重要意義?；ㄉ率腔ㄉa(chǎn)品的副產(chǎn)物，資源豐富，價(jià)格低廉，含有多種黃酮類多酚物質(zhì)、具有抗氧化，阻礙蛋白糖化反應(yīng)的作用[8-9]，從中提取的花生衣紅色素營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和醫(yī)用價(jià)值都很高，而且還具有良好的抗氧化能力，因此在食品、醫(yī)藥等行業(yè)中將有良好的應(yīng)用前景[10]。本文以花生為原料，研究了花生紅衣組分對(duì)花生分離蛋白及其水解產(chǎn)物理化和抗氧化性質(zhì)的影響，為植物蛋白理化功能性質(zhì)的改善提供數(shù)據(jù)支持，對(duì)植物蛋白的深加工和相關(guān)的保健品開發(fā)都有積極的意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

花生 購(gòu)于廣州市五山金莎超市；堿性蛋白酶 諾維信生物技術(shù)有限公司；所用化學(xué)試劑 均為分析純。

CR22G高速冷凍離心機(jī) 日本日立公司；Master2000粒度分布儀 英國(guó)Malvern公司；高效液相色譜儀Waters1525 美國(guó)Waters公司；熒光分光光度計(jì)F-7000 日本日立公司；紫外-可見分光光度計(jì)2501PC 日本島津公司；高壓微射流納米均質(zhì)機(jī)M-110EH 美國(guó)Microfluidics公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 花生分離蛋白的制備 將脫紅衣和不同紅衣的花生用正己烷脫脂后，所得花生粕打粉，以1∶15（w/v）加入蒸餾水后調(diào)pH至9.0，室溫緩慢攪拌2h過篩，離心（6500×g，20min，25℃），取上清液調(diào)pH至4.5，離心（6500×g，20min，25℃），取沉淀以1∶10加水調(diào)pH至7.5透析，冷凍干燥得到花生分離蛋白樣品。

1.2.2 花生濃縮蛋白的限制性水解 配制濃度為2%的花生分離蛋白分散液于恒溫水浴中，加入一定量的堿性蛋白酶進(jìn)行水解，根據(jù)pH-stat法[11-12]，用0.5N NaOH調(diào)節(jié)pH，繪制水解曲線。根據(jù)水解曲線，確定水解度為DH5、DH10和DH15的水解時(shí)間。

1.2.3 表面疏水性（H0） 表面疏水性的測(cè)定采用ANS熒光探針法[13]。將待測(cè)蛋白樣品溶于10mmol/L磷酸緩沖液（pH7.0）中，蛋白質(zhì)濃度為1.5%（w/v）。向含4mL磷酸緩沖液的塑料離心管中分別添加10、20、30、40、50μL 1.5%的蛋白質(zhì)溶液，在測(cè)試前添加20μL 8mmol/L ANS儲(chǔ)液，振蕩均勻，在8～15min內(nèi)采用天美熒光分光光度計(jì)檢測(cè)樣品的熒光強(qiáng)度（FI）。激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)分別為390nm和470nm，激發(fā)和發(fā)射狹縫寬均為5nm。樣品的熒光強(qiáng)度值扣除試劑空白值即為蛋白的相對(duì)熒光強(qiáng)度值。以相對(duì)熒光強(qiáng)度對(duì)蛋白質(zhì)濃度作圖，其初始段的斜率作為蛋白質(zhì)的表面疏水性指數(shù)（H0）。

1.2.4 分子量分布的測(cè)定 采用凝膠過濾色譜（GPC）方法。用50mmol/L磷酸鹽緩沖液（pH7.2）將樣品配制成質(zhì)量濃度為5‰的溶液，攪拌1.5h，1000r/min離心，上清液過0.2μm過濾器，上樣量10μL，過G2000SWXL凝膠過濾柱，上樣后用50mmol/L磷酸鹽緩沖液（pH7.2）洗脫，Waters1525高效液相色譜控制流速0.7mL/min，測(cè)定280nm波長(zhǎng)處的吸光度。

1.2.5 溶解度曲線的測(cè)定[14]稱取8份100mg蛋白樣品分別分散于10mL的去離子水中，室溫下磁力攪拌30min，然后用1mol/L NaOH或HCl溶液調(diào)節(jié)溶液的pH到2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0，再攪拌30min后，在20℃離心（12000×g，20min）。上清液經(jīng)過適度稀釋后，采用Lorry法[15]測(cè)定蛋白質(zhì)含量，以牛血清白蛋白（BSA）為標(biāo)準(zhǔn)物做標(biāo)準(zhǔn)曲線。蛋白質(zhì)的溶解度表示為上清液蛋白濃度占總蛋白濃度的百分比。

1.2.6 乳液粒度分布的測(cè)定 向10mmol/L磷酸鹽緩沖液（pH7.0）中添加0.5%蛋白，10%油，通過微射流處理制備乳液，采用粒度分布儀測(cè)定乳液中粒子大小及其分布，計(jì)算表面積平均粒徑d3，2。

1.2.7 多酚（黃酮）含量的測(cè)定 參考Carbonaro等[16]的方法。用0.1mol/L的NaOH溶液配制1mg/mL的樣品溶液，充分振蕩混勻，10000×g離心15min，于328nm處測(cè)定吸光度A1（總多酚），之后加入5%質(zhì)量分?jǐn)?shù)的三氯乙酸（TCA），沉淀蛋白質(zhì)，10000×g離心15min，于328nm處測(cè)定吸光度A2（游離多酚），A1-A2即為結(jié)合多酚對(duì)應(yīng)的吸光度值。多酚含量以“g蘆丁當(dāng)量/100樣品”為單位，通過以蘆丁為標(biāo)樣的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算。

1.2.8 DPPH·清除能力的測(cè)定 參考Shimada等[17]的方法。配制濃度為1mg/mL蛋白貯液，稀釋成濃度為0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mg/mL的樣品溶液各2mL，加入0.2mmol/mL的DPPH乙醇溶液（現(xiàn)配）2mL，振蕩搖勻，在室溫下放置30min后，以無(wú)水乙醇為空白，于517nm處測(cè)定吸光值。DPPH·清除率（%）=[1-（AS/Ab）]×100%，式中，AS為樣品溶液對(duì)應(yīng)吸光度值；Ab為蒸餾水對(duì)應(yīng)吸光值。

2 結(jié)果與討論

2.1 紅衣組分對(duì)花生分離蛋白水解產(chǎn)物理化性質(zhì)的影響

2.1.1 紅衣組分對(duì)花生分離蛋白水解曲線的影響 水解度（DH）變化曲線如圖1所示，在水解開始的1h內(nèi)，DH增加最快，但是在3h到4h之間，隨著時(shí)間的增加，DH增加速度明顯減小。隨著E/S比例的提高，水解度DH增速在25min內(nèi)明顯提高，在180min以后，增速明顯減小。比較脫紅衣、含紅衣的水解曲線，相同E/S比例、相同時(shí)間下，不含紅衣的水解度明顯高于含紅衣的水解度，說明經(jīng)脫紅衣處理的分離蛋白更易被堿性蛋白酶水解。因?yàn)榧t衣成分主要是多酚類物質(zhì)，脫紅衣處理減少了多酚與蛋白的反應(yīng)，使堿性蛋白酶的作用位點(diǎn)保持活性；同時(shí)較低的酚含量也降低了多酚與蛋白酶相互作用的幾率，Sripad[18]等研究表明多酚的存在對(duì)蛋白的酶水解有一定的抑制作用。

圖1 紅衣組分對(duì)花生分離蛋白水解曲線的影響Fig.1 Effect of peanut red skin on the hydrolysis curve of PPI at different E/S ratio

考慮到限制性酶解的可控性，若按E/S 2∶100或者4∶100進(jìn)行酶解，在短時(shí)間內(nèi)就達(dá)到DH5，不利于酶解時(shí)間的控制；同時(shí)為了節(jié)約酶制劑的使用量，本研究采用E/S 1∶100的水解度曲線進(jìn)行限制性酶解，根據(jù)水解度曲線，分別酶解脫紅衣、含紅衣花生分離蛋白，以制備DH5、DH10、DH15的水解產(chǎn)物。

2.1.2 紅衣組分對(duì)水解產(chǎn)物表面疏水性的影響 圖2表明，水解產(chǎn)物的表面疏水性明顯減小，可能的原因是：酶解將球蛋白或者聚集體中的表面疏水基團(tuán)降解了；滅酶過程中同樣會(huì)去除一些酶解產(chǎn)生的疏水性肽段或蛋白片段。圖中，DH15的疏水性指數(shù)大于DH5和DH10的疏水性，可能是隨著深度酶解的進(jìn)行，酶解產(chǎn)生了更穩(wěn)定的小分子量疏水性肽段。

圖2 花生分離蛋白及其水解產(chǎn)物的表面疏水性指數(shù)Fig.2 Surface hydrophobicity of PPI and its hydrolysates

比較脫紅衣、含紅衣分離蛋白及其水解產(chǎn)物的表面疏水性，相同水解度條件下，含紅衣的表面疏水性小于脫紅衣的，因?yàn)榧t衣里面多酚類物質(zhì)跟部分表面疏水基團(tuán)結(jié)合，從而降低了表面疏水性。

2.1.3 紅衣組分對(duì)水解產(chǎn)物GPC的影響 圖3中，花生分離蛋白及其水解產(chǎn)物的分子量分布結(jié)果表明，酶解以后分子量明顯減小，分離蛋白在9min處的吸收峰完全消失，而在17min處有一個(gè)較分離蛋白更大的吸收峰出現(xiàn)，說明酶解使得分離蛋白中的大分子變成了小分子，同時(shí)，隨著水解度的增大，17min處的峰也增大，說明水解度增大，小分子物質(zhì)增多。

圖3 花生分離蛋白及其水解產(chǎn)物的分子量分布（GPC）Fig.3 GPC of PPI and its hydrolysates

不同樣品的上樣量均為10μL，相同水解度條件下，含紅衣分離蛋白及其水解產(chǎn)物的峰值大于脫紅衣，可能是因?yàn)閳D4中含紅衣的溶解度大于脫紅衣的，樣品經(jīng)離心處理后，含紅衣樣品中蛋白濃度大于脫紅衣的，從而導(dǎo)致在相同上樣量的條件下峰值也相應(yīng)增大。

2.1.4 紅衣組分對(duì)水解產(chǎn)物溶解性的影響 文獻(xiàn)[19]報(bào)道花生多肽溶液能在較寬的pH范圍內(nèi)保持溶解狀態(tài)，圖4顯示，酶解產(chǎn)物溶解度明顯高于花生分離蛋白，而且隨著水解度的增大，水解產(chǎn)物的溶解性也增大。相同水解度條件下，含紅衣分離蛋白及其水解產(chǎn)物的溶解性好于脫紅衣的，這跟文獻(xiàn)[4]報(bào)道的多酚類物質(zhì)與蛋白作用能夠提高蛋白的溶解性相一致。

2.1.5 紅衣組分對(duì)水解產(chǎn)物乳化性的影響 乳狀液的粒度分布與表面積平均粒徑（d3，2）可表征樣品的乳化特性[20]。其中粒度分布在一定程度上可反映乳狀液的穩(wěn)定性；乳狀液表面積平均粒徑（d3，2）的大小可反映樣品的乳化活性，一般d3，2較小則其乳化活性較好。

花生分離蛋白及其水解產(chǎn)物的乳狀液粒度分布變化見圖5，脫紅衣PPI的粒度分布呈雙峰分布，含紅衣PPI的粒度分布呈單峰分布，且平均粒度小于脫紅衣PPI，這表明紅衣組分能夠提高PPI的乳化穩(wěn)定性。脫紅衣、含紅衣不同水解產(chǎn)物的粒度分布都呈雙峰分布，但含紅衣水解產(chǎn)物的平均粒度小于脫紅衣的水解產(chǎn)物，這說明紅衣組分也能夠提高水解產(chǎn)物的乳化穩(wěn)定性。

圖4 花生分離蛋白及其水解產(chǎn)物溶解度的比較Fig.4 Solubility of PPI and its hydrolysates

圖5 花生分離蛋白及其水解產(chǎn)物乳狀液粒度分布的比較Fig.5 Particle size distribution of emulsions made with PPI and its hydrolysates

圖6 乳狀液表面積平均粒徑的變化Fig.6 Mean diameter per particle surface area of emulsions made with PPI and its hydrolysates

從圖6的表面積平均粒徑變化來看，相同水解度條件下，含紅衣水解產(chǎn)物的d3，2值小于不含紅衣，3d以后，含紅衣水解產(chǎn)物的d3，2增幅小于不含紅衣的。這表明紅衣成分能夠提高水解產(chǎn)物的乳化活性，與文獻(xiàn)[5]報(bào)道的多酚能夠提高蛋白的乳化性相一致。

圖6表明，DH5的d3，2值小于分離蛋白的d3，2值，說明DH5的乳化活性較強(qiáng)，這是因?yàn)橄拗菩悦附鈱⒎蛛x的剛性結(jié)果部分切割成柔性結(jié)構(gòu)，使分子的結(jié)構(gòu)變得柔軟，具有更高的乳化活性，但是隨著水解程度的進(jìn)一步增大（DH10、DH15），水解蛋白分子變?yōu)楦〉亩屉?，無(wú)法很好地在油水界面上形成具有一定粘彈性的界面膜以防止油滴聚集成大粒子，所以乳化活性與穩(wěn)定性較差。

2.2 紅衣組分對(duì)花生分離蛋白水解產(chǎn)物抗氧化性的影響

2.2.1 紅衣組分對(duì)水解產(chǎn)物多酚含量的影響 圖7比較了花生分離蛋白在酶解過程中多酚含量及結(jié)合方式的變化，包括總酚含量、共價(jià)結(jié)合酚以及以弱電作用結(jié)合的游離酚含量，花生分離蛋白總多酚含量、游離多酚含量最多，水解產(chǎn)物總多酚含量、游離多酚含量減少。但是隨著水解度的增大，總多酚含量、游離多酚含量也增多。由于紅衣富含多酚類物質(zhì)，所以相同水解度條件下，含紅衣的水解產(chǎn)物多酚含量顯著高于脫紅衣的。

圖7 花生分離蛋白及其水解產(chǎn)物的多酚含量比較Fig.7 Polyphenol contents of PPI and its hydrolysates

2.2.2 紅衣組分對(duì)水解產(chǎn)物DPPH·清除能力的影響圖8中，以抗氧化劑BHT為參比，BHT在0.1mg/mL時(shí)的清除率達(dá)到86%，遠(yuǎn)高于同濃度下其他被測(cè)樣品的抑制率。相同水解度條件下，含紅衣水解產(chǎn)物的清除率明顯高于脫紅衣的，聯(lián)系多酚含量的分析數(shù)據(jù)可知（圖7），多酚含量的差異與花生分離蛋白及其酶解產(chǎn)物的DPPH·抑制率存在較大正相關(guān)性，較高的酚含量，尤其是游離酚含量有助于提高DPPH自由基清除率。

圖8 花生分離蛋白及其水解產(chǎn)物清除DPPH·能力比較Fig.8 DPPH·radical scavenging activity of PPI and its hydrolysates

酶解之后，分離蛋白對(duì)應(yīng)酶解產(chǎn)物的清除能力均有所減弱，酶解產(chǎn)物中DH15的清除能力最強(qiáng)，含紅衣的樣品濃度達(dá)到1.0mg/mL時(shí)，DH15的DPPH·抑制率為46.9%。

3 結(jié)論

本研究比較了紅衣組分對(duì)花生分離蛋白酶解產(chǎn)物理化和抗氧化性質(zhì)的影響，研究發(fā)現(xiàn)：紅衣的存在對(duì)蛋白的酶解有一定的抑制作用，含紅衣的分離蛋白酶解速度低于不含紅衣的；相同水解度條件下，含紅衣的表面疏水性小于脫紅衣的，GPC分布中，含紅衣的峰值大于脫紅衣的；紅衣組分能夠提高花生分離蛋白及其酶解產(chǎn)物的溶解性、乳化穩(wěn)定性、乳化活性；在相同水解度條件下，含紅衣的酶解產(chǎn)物多酚含量顯著高于脫紅衣的，多酚含量的差異與花生分離蛋白及其酶解產(chǎn)物的抗氧化性具有正相關(guān)性，較高的酚含量，能提高DPPH自由基清除率。

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Effect of peanut red skin on the physicochemical and antioxidant properties of peanut protein isolate and its hydrolysates

GU Wei1，YANG Xiao-quan1，*，LIU Yuan-yang2，GUO Jian1，REN Xiao-ming1
（1.Research and Development Centre of Food Protein，College of Light Industry and Food Science，South China University of Technology，Guangzhou 510640，China；2.College of Food Science，Heilongjiang August First Reclamation University，Daqing 163319，China）

Peanut was used as raw material，the effects of peanut red skin on the physicochemical and antioxidant properties of peanut protein isolate（PPI）and its hydrolysates were studied.The results showed that：the hydrolysis speed of PPI with peanut red skin was slower than PPI without peanut red skin；under the conditions of the same value of DH，surface hydrophobicity of PPI with peanut red skin was less than PPI without peanut red skin；in the distribution of GPC，the peak of PPI with peanut red skin was greater than PPI without peanut red skin；peanut red skin could improve the solubility，emulsion stability and emulsifying activity of PPI and its hydrolysates；under the conditions of the same value of DH，content of polyphenol of hydrolysates of PPI with peanut red skin was significantly increased，content of polyphenol had a positive correlation with antioxidant properties of PPI and its hydrolysates.

peanut red skin；peanut protein isolate；hydrolysates；physicochemical properties；antioxidant activities

TS201.2+1

A

1002-0306（2012）03-0106-05

2011－05－16 *通訊聯(lián)系人

顧煒（1986-），男，碩士，研究方向：蛋白質(zhì)化學(xué)與工程?；痦?xiàng)目：廣東省重大科技專項(xiàng)（2009A080209001）。