銀杉根際微生物群落結(jié)構(gòu)初步研究

易思榮，肖 波，黃 婭，全 健，韓 風，韋中強，曹厚強

（重慶市藥物種植研究所，重慶 408435）

銀杉（Cathaya argyrophylla）是我國特有的第三紀孑遺植物。遠在第三紀銀杉的家族廣布于北半球的歐亞大陸，在第四紀發(fā)生的冰川襲擊下，銀杉才在地球上幾乎絕跡，僅在中國亞熱帶山地的局部地區(qū)有零星殘存。迄今為止，天然銀杉林已在廣西、重慶、貴州和湖南4省區(qū)發(fā)現(xiàn)有分布，基本上間斷分布于大婁山、越城嶺、八面山和大瑤山，其垂直分布幅度較大，最低分布線為海拔920m，最高分布線達1 840m。但高于1 m的銀杉個體總數(shù)不超過5 000棵[1]。

銀杉起源古老，形態(tài)特別，對裸子植物中松科的系統(tǒng)發(fā)育和進化的研究，以及古生物、古氣候、古地質(zhì)和古生態(tài)方面的研究都有重要的科學(xué)價值，被公認為當今世界最珍貴的植物之一，為我國國家一級重點保護野生植物。銀杉作為一種瀕危植物，自1955年被發(fā)現(xiàn)以來，即引起了國內(nèi)外有關(guān)學(xué)者的廣泛關(guān)注和重視，在許多方面的研究都取得了重要進展。近年來，隨著對生物多樣性保護的高度重視和保護生物學(xué)學(xué)科的迅速發(fā)展，銀杉再次受到世人的關(guān)注，銀杉種群的瀕危機制、種群退化和未來命運成為研究熱點。本文在了解銀杉種群退化的前提條件下致力于對金佛山國家級自然保護區(qū)分布的銀杉的根際微生物開展初步研究，以期掌握銀杉根際微生物的主要類群及其動態(tài)變化概況。

1 研究地區(qū)概況

金佛山國家級自然保護區(qū)位于重慶市南部南川市境內(nèi)（東經(jīng) 106°54′～107°27′，北緯 28°46′～29°38′），東接貴州省道真縣，南鄰貴州省正安縣、桐梓縣，西連萬盛區(qū)、綦江縣、巴南區(qū)，北與涪陵接壤，最高點為風吹嶺，海拔2 251 m，最低點在騎龍鄉(xiāng)柏林的魚跳巖，海拔340m，相對高差1 911m，面積約1 300 km2。金佛山屬亞熱帶濕潤季風氣候區(qū)，全年氣候溫和，四季分明，雨量充沛，既無嚴寒，又無酷署，立體氣候明顯。年平均氣溫8.3℃，極端低溫-14.4℃，極端高溫29.2℃，年平均降水量1 395.5 mm，平均年日照時數(shù)1 079.4 h。平均年≥10℃的活動積溫 5 435℃，相對濕度90%。金佛山屬貴州大婁山東段的一條支脈，形成于燕山運動后期，其后又受到喜馬拉雅造山運動的影響，在長期的內(nèi)外應(yīng)力的作用下，形成了深溝峽谷、峭壁懸崖和無數(shù)大斷層，山體主要由灰?guī)r和石灰?guī)r組成，局部地區(qū)分布有玄武巖、頁巖、砂巖及變質(zhì)巖等，主要土壤類型有黃壤、黃棕壤及少量亞高山草甸土[2-4]。

金佛山屬于中國－日本森林植物亞區(qū)的華中地區(qū)，位于我國三大特有現(xiàn)象中心之一的鄂西—川東植物分布中心，從地理位置分析，它不僅位于東西植物分布的交界地帶，也處于南北植物分界的邊緣地區(qū)，是眾多野生植物的自然分化中心或分布中心[5-6]；另外由于金佛山處于亞熱帶濕潤氣候區(qū)，長期受太平洋濕潤季風氣候的影響，生物氣候條件十分優(yōu)越，再加之第四紀冰川運動時受到的影響很小，使部分亞熱帶珍稀瀕危植物得到保存、繁衍和發(fā)展，故區(qū)內(nèi)植物種類繁多，類型復(fù)雜多樣，形態(tài)特征各異，不同地質(zhì)年代的植物和不同區(qū)系成分的植物常?；旌显谝粋€植物群落里，珍稀、孑遺植物也相當豐富，是我國不可多得的中亞熱帶植物集中分布中心。

2 材料與方法

2.1 樣品采集

根據(jù)金佛山自然保護區(qū)內(nèi)銀杉分布區(qū)的地形地貌、海拔高度、自然植被等特征，選擇6處有代表性的取樣點設(shè)立標準樣地。在各標準樣地內(nèi)選擇標準木3株，在標準木下挖出表層（0～20 cm）細根（<5 mm），作為獲取根際土壤的材料，同時按S形在各標準樣地內(nèi)布點（3～5點），取0～20 cm非根際土壤。將采集的土樣放入已消毒的紙袋，封口并放入消毒密閉的塑料袋，帶回實驗室立即進行檢測和微生物的分離培養(yǎng)。采樣時間分別為3月13日、6月20日、9月18日和12月17日。

2.2 樣品處理

稱取一定量的銀杉根條，置于裝有定量無菌水的容器中，振蕩15～20min，洗下的土壤溶液即為根際土壤懸液。用無菌鑷子取出銀杉根條，用濾紙吸干表面水分稱重，即可計算出根際土壤的重量。稱取一定量的非根際土，置于裝有定量無菌水的容器中，振蕩15～20 min制成非根際土懸液。從野外采集回來未能及時處理的土壤樣品保存于4℃冰箱中。

2.3 土壤pH值和含水量測定

將采集回來的土樣與水按照一定的比例混合后用精密pH計測定土壤pH值。稱取定量的新鮮土壤置于金屬容器稱量，在恒溫烘箱中烘干至恒重后稱重，計算土壤含水量。

2.4 菌株的分離和培養(yǎng)

采用稀釋平板法分別測定不同取樣點銀杉根際土懸液和非根際土懸液的細菌、真菌和放線菌數(shù)量。真菌采用PSA培養(yǎng)基，細菌采用NA培養(yǎng)基，放線菌采用改良高氏1號培養(yǎng)基。各土壤溶液分別取100μL置于PDA培養(yǎng)基平板中央，并使用無菌玻璃棒均勻涂布，然后在不同條件下培養(yǎng)。細菌置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～4 d后計數(shù)，真菌置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～4 d后計數(shù)，放線菌置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6～7 d后計數(shù)。再將獲得的菌株進行分離、純化和編號，并接種于相應(yīng)培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，置于4℃條件下保存，用于分類鑒定。

2.5 土壤微生物種群數(shù)量測定與分類鑒定

細菌、放線菌和真菌的活菌計數(shù)培養(yǎng)基分別為牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、高氏1號瓊脂培養(yǎng)基、孟加拉紅瓊脂培養(yǎng)基，具體培養(yǎng)方法見參考文獻[7]，并采用CFU（Colony Forming Unit）法進行計數(shù)。優(yōu)勢菌株的分類鑒定遵循以生理生化特征為主，以形態(tài)結(jié)構(gòu)、菌落特征為輔的原則，依據(jù)經(jīng)典的分類方法[8-10]進行。

3 結(jié)果與分析

3.1 土壤pH值和含水量檢測

不同季節(jié)采集回來的土樣需要及時進行檢測，將其與水按照1:5的比例混合后用精密pH計測定土壤的pH值。另稱取各新鮮土樣10.0 g放入金屬容器中稱重，再置于恒溫烘箱中烘干至恒重后稱重，計算出土壤含水量。結(jié)果表明春、夏、秋、冬四季銀杉林地土壤的pH值分別為6.74、6.93、7.03和6.83，土壤的含水量分別為 16.33%、12.23%、10.76%和14.56%。

3.2 根際微生物數(shù)量和組成

經(jīng)過培養(yǎng)分離和鑒定，銀杉根際微生物中細菌、放線菌及真菌的數(shù)量分別細菌7.35×105cfu/g、放線菌 7.65×104cfu/g、真菌 1.11×104cfu/g，分別占根際微生物總量的89.35%、9.30%和1.35%，其中細菌的數(shù)量最多，放線菌次之，真菌的數(shù)量最少，與其他物種的根際微生物的分布規(guī)律相符合。表明細菌在促進土壤C、N、P等元素的轉(zhuǎn)化及維持生態(tài)平衡等方面發(fā)揮主導(dǎo)作用。

3.3 細菌的初步鑒定結(jié)果

從不同季節(jié)的銀杉根際土壤中分離到的細菌總計4個屬，共計14株。其中，芽孢桿菌屬（Bacillus）8 株、假單胞菌屬（Pseudomonas）3株、微球菌屬（Micrococcus）2株、土壤桿菌屬（Agrobacterium）1株，分別占細菌總株數(shù)的57.14%、21.43%、14.29%和7.14%。土壤中芽孢型細菌的主要類群有巨大芽孢桿菌（B.megaterium）、地衣芽孢桿菌（B.licheniformis）、蠟質(zhì)芽孢桿菌（B.cereus）等。

3.4 放線菌的初步鑒定結(jié)果

從不同季節(jié)的銀杉根際土壤中分離到的放線菌分屬2個屬，共計12株。其中，鏈霉菌屬（Streptomyces）菌株有8株，分屬3個種，即微白鏈霉菌（S.albidus）4 株、綠黃鏈霉菌（S.viridoflavus）3 株、灰色鏈霉菌（S.griseus）1株，鏈霉菌屬占總株數(shù)的92.31%；諾卡氏菌屬（Nocardia）有1株，為綠色諾卡氏菌（N.viridis），諾卡氏菌屬占總株數(shù)的7.69%。

3.5 真菌的初步鑒定結(jié)果

從秋季樟子松根際土壤中分離到的真菌分屬3個屬，共計10株。其中青霉屬（Penicillium）有5株，木霉屬（Trichoderma）3株，毛霉屬（Mucor）有 2株，分別占分離到的真菌總菌株數(shù)的50%、30%和20%。

4 小結(jié)與討論

4.1 主要結(jié)果

通過對不同季節(jié)采集回來的銀杉根際土樣分析檢測，春、夏、秋、冬四季銀杉林地土壤的pH值分別為6.74、6.93、7.03和6.83，土壤的含水量分別為16.33%、12.23%、10.76%和14.56%。

通過對銀杉根際微生物的分離培養(yǎng)和鑒定，銀杉的根際微生物中細菌、放線菌及真菌的數(shù)量分別細菌 7.35×105cfu/g、放線菌 7.65×104cfu/g、真菌1.11×104cfu/g，分別占根際微生物總量的89.35%、9.30%和1.35%。

其中細菌總計4個屬，包括芽孢桿菌屬、假單胞菌屬、微球菌屬和土壤桿菌屬，放線菌有鏈霉菌屬和諾卡氏菌屬，真菌有青霉屬、木霉屬和毛霉屬。

4.2 前期研究結(jié)果

前期研究中，針對銀杉的根際微生物研究報道極少，僅邢樹堂等[11]報道了銀杉外生菌根的觀察方法，且試驗材料為銀杉的種子，隨后趙穎茹[12]對廣西花坪自然保護區(qū)的兩株銀杉開展了根際土壤真菌的分離與鑒定，而其他研究中主要集中于群落結(jié)構(gòu)與生長發(fā)育規(guī)律等方面[1,13-15]。

韓艷潔[16]對內(nèi)蒙古大青山的幾種喬木樹種人工林的根際微生物的數(shù)量和動態(tài)分布情況予以了報道，結(jié)果表明人工油松林、人工落葉松林和天然次生白樺山楊林的根際微生物的數(shù)量等級均達到了107cfu/g以上；高明華等[17]從樟子松根際土壤中分離到細菌6屬、放線菌2屬、真菌3屬，研究結(jié)果表明各類群根際微生物數(shù)量均有明顯的季節(jié)變化。其他針對松科植物根際微生物的研究未見報道。

4.3 討論

研究結(jié)果表明銀杉根際微生物中細菌在數(shù)量基本上比放線菌和真菌高1個數(shù)量級，說明在微生物總體數(shù)量上細菌占絕對優(yōu)勢，銀杉的根際微生物在數(shù)量上至少較其他松科植物低1～2個數(shù)量級，同時不論從類群數(shù)量還是個體數(shù)量上，銀杉的根際微生物總量都不及其他松科植物豐富。

前期研究結(jié)果表明，細菌有利于促進土壤中有機殘體的分解和潛在養(yǎng)分的轉(zhuǎn)化，提高土壤的供肥能力，釋放出的CO2可供植物進行光合作用[18]。根際微生物種類和數(shù)量越大，土壤微生物的活性越強，越能促進植物的生長。另外土壤中的細菌產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)能影響其他土壤微生物的生長，從而直接影響了土壤微生物的群落結(jié)構(gòu)[19]。由此筆者推測目前各地普遍存在的銀杉種群退化、個體生長緩慢、種子自然萌發(fā)率低和成苗率低等現(xiàn)象，極有可能與銀杉的根際微生物群落結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，因此有必要在這方面開展更加深入的研究。

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