IVF-ET周期中1PN及0PN胚胎的非整倍體研究進(jìn)展

韋 多，張翠蓮，宋小兵，謝娟珂，劉 琦，呼 琳，殷寶莉

(河南省人民醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心 河南鄭州 450003)

在人類體外授精-胚胎移植(in vitro fertilizationembryo transfer，IVF-ET)技術(shù)中，國(guó)內(nèi)外許多學(xué)者在授精18～20 h內(nèi)通過光學(xué)顯微鏡對(duì)胚胎原核數(shù)目進(jìn)行觀察及評(píng)分［1］，以觀察到明確的2PN(pronucleus)及2PB(polar body)作為正常受精的判斷標(biāo)準(zhǔn)［2］，從中選擇優(yōu)質(zhì)的胚胎進(jìn)行移植。1PN、0PN通常被視為異常受精胚胎［3］，與多原核及發(fā)育停滯的2PN胚胎一同作為廢棄胚胎被銷毀，目前此方法被廣大中心所采用。但是出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因一部分是由于錯(cuò)過了最佳的觀察時(shí)機(jī)，從而可能造成胚胎資源的浪費(fèi)。從提高IVF-ET成功率，降低治療周期取消率，減少染色體病患兒出生的角度出發(fā)，如果要將這部分胚胎加以利用，研究其染色體非整倍體性，對(duì)判斷其移植價(jià)值有著重要意義。

1 對(duì)1PN及0PN胚胎利用的必要性

染色體非整倍體改變?cè)谌祟怚VF-ET周期中十分常見，它可導(dǎo)致自發(fā)流產(chǎn)、死產(chǎn)以及早期胚胎丟失等，進(jìn)而造成妊娠失敗。21號(hào)染色體三倍體引起的Down綜合癥患者發(fā)育遲緩、智力低下，13號(hào)染色體三倍體患者智力嚴(yán)重缺陷且伴有兔唇。染色體疾病在人群中的爆發(fā)率相當(dāng)高，在新生兒中，發(fā)病率高達(dá)7.3‰，18號(hào)染色體三倍體所引發(fā)的Edward綜合癥在人群中的爆發(fā)率也高達(dá)1/2 000。研究表明，13、18、21、X和 Y染色體異常所引起的疾病占新生兒染色體疾病的85%～90%。染色體非整倍體改變是導(dǎo)致胚胎移植后受孕率低、胚胎著床率低且流產(chǎn)率高的重要原因之一［4］。異常受精胚胎因染色體非整倍體發(fā)生率較高而常被廢棄，不用于移植［5］。在IVF-ET治療過程中，約4%的患者因受精異常等原因而沒有正常受精胚胎移植，導(dǎo)致治療周期取消，這給患者精神上帶來(lái)很大的痛苦和壓力，同時(shí)也造成了財(cái)力及人力的大量浪費(fèi)。

細(xì)胞遺傳學(xué)研究［1］顯示大部分3PN胚胎為三倍體或單倍體和二倍體的嵌合體，盡管有10%左右的3PN胚胎顯示為二倍體，但異常的紡錘體結(jié)構(gòu)和數(shù)目可能導(dǎo)致異常的細(xì)胞分裂，從而產(chǎn)生高比例的復(fù)雜嵌合體胚胎，因此，3PN胚胎是不適于移植的。Manor等［6］研究發(fā)現(xiàn)0PN胚胎中57%(13/23)為二倍體胚胎，另外有學(xué)者通過細(xì)胞遺傳學(xué)方法發(fā)現(xiàn)，發(fā)生分裂的1PN胚胎中80%為二倍體，12%為單倍體，7%為三倍體［7］。0PN及1PN胚胎中的二倍體胚胎均占有較大比率。

在體外受精-胚胎移植技術(shù)中，1PN和0PN胚胎的發(fā)生率分別約為3% ～6%［8］和30% ～40%，這是一個(gè)不小的比例。多數(shù)學(xué)者認(rèn)為，異常受精胚胎常存在染色體非整倍體異常，不具有移植價(jià)值［6，9］，多數(shù)中心也選擇授精第2天觀察受精原核為2PN的胚胎移植。但是，這并不代表光學(xué)顯微鏡下觀察到具有2PN及2PB的卵子被認(rèn)為受精正常，其他情況就都為異常［1］。一些細(xì)胞和分子生物學(xué)研究［10-11］已經(jīng)表明，某些在光學(xué)顯微鏡下觀察判斷為異常受精的胚胎實(shí)際上是正常的二倍體胚胎，即體外受精胚胎的原核數(shù)目觀察可能對(duì)胚胎移植的價(jià)值做出錯(cuò)誤判斷。因此，在沒有正常受精胚胎可供移植的情況下，可選擇1PN或者0PN胚胎移植。目前已有移植1PN和0PN胚胎出生正常新生兒的報(bào)道［7，12-14］。

2 IPN及0PN的發(fā)生機(jī)制及研究進(jìn)展

2.1 正常的受精過程及雌雄原核的形成 正常的受精過程包括一系列在時(shí)間上按先后順序發(fā)生的事件的綜合［1，15-17］。精子穿過透明帶后，其胞膜與卵子胞膜融合，然后遺傳物質(zhì)進(jìn)入卵子，此過程導(dǎo)致胞質(zhì)釋放Ca2+產(chǎn)生Ca2+波，從而激活卵子［18］。卵子的激活包括釋放皮質(zhì)顆粒［19］改變透明帶內(nèi)層結(jié)構(gòu)避免多精受精等一系列分子反應(yīng)。卵子激活后，第二次減數(shù)分裂恢復(fù)并排出含有單倍體母源遺傳物質(zhì)的第二極體［20］，親本染色體去凝集及選擇性的去甲基化［21］之后原核形成，其中雄原核在精子穿入點(diǎn)的卵膜下方形成并被母源核膜包被［15］，雌原核在第二極體分裂出來(lái)的正下方同時(shí)形成［22］。隨后，在精子中心粒的星狀體微管及微絲作用下，雌雄原核同時(shí)向卵子中央移動(dòng)，直至兩原核核膜解聚，雙方染色體重組，即核融合形成二倍體胚胎［23-24］，并開始有絲分裂。

2.2 1PN發(fā)生機(jī)制及國(guó)內(nèi)外研究進(jìn)展 體外受精-胚胎移植周期中，1PN的發(fā)生率約為3% ～6%［8］。1PN的發(fā)生具體機(jī)制目前尚不明確，但單原核并不一定代表未受精。已有大量的研究［1］報(bào)道了1PN的細(xì)胞遺傳分析結(jié)果，這些結(jié)果一定程度上闡明了1PN的形成機(jī)制。目前認(rèn)為1PN可能的發(fā)生機(jī)制有以下方面。

2.2.1 孤雌激活(parthenogenesis):1PN2PB胚胎形成的主要機(jī)制之一是孤雌激活，其原核為母源的。人類卵子的孤雌激活率較低，激活刺激源可以是鈣離子阻滯劑、蛋白激酶激活劑、電刺激和顯微注射時(shí)的機(jī)械刺激。與常規(guī)IVF(conventional IVF，c-IVF)比較，ICSI的1PN胚胎更可能是由于孤雌激活所致。Feng等［25］發(fā)現(xiàn)，ICSI周期中的1PN胚胎多伴有染色體異常，僅有10%的胚胎含有Y染色體，表明ICSI中單原核胚胎可能是由于孤雌生殖而非受精形成。

2.2.2 精子染色體解聚異常:精子染色體解聚異常導(dǎo)致雄性原核不能形成，即卵母細(xì)胞已經(jīng)被注入的精子激活，但是精子自身未形成原核，這也是1PN形成的主要原因之一，大約50%的ICSI-1PN是由于這一原因造成的［26］，這些胚胎表現(xiàn)為1PN2PB。

2.2.3 雌性原核形成異常:雌性原核形成異常也可導(dǎo)致1PN，例如ICSI中將精子注入減數(shù)分裂紡錘體中會(huì)影響第二極體排出，并抑制了雌性原核形成，可導(dǎo)致1PNlPB 卵子［27］。

2.2.4 雌雄原核融合:Levron等［6］推測(cè)某些1PN 為正常受精胚胎，但受精提前，雌雄兩個(gè)原核已經(jīng)融合為1個(gè)，或在未形成原核膜前就融合了，這樣融合的單個(gè)原核可能要大些。

2.2.5 雌雄原核形成不同步(asynchronously):原核不同步發(fā)育也是形成1PN二倍體胚胎的原因。Payne等［22］通過實(shí)時(shí)錄像記錄ICSI后卵子的原核變化，發(fā)現(xiàn)38%(12/32)的受精卵子的原核發(fā)育是不同步的，如果在第一次觀察后4～6 h再次觀察原核情況，約25%的1PN卵子可見第2個(gè)原核［28］。

1PN來(lái)源的胚胎中單倍體和二倍體的發(fā)生率各文獻(xiàn)報(bào)道不一，研究顯示IVF-1PN卵子大約50%以上是二倍體，ICSI-1PN胚胎多為單倍體，只有不到30%的1PN卵子是正常二倍體［12，28-29］。有學(xué)者通過細(xì)胞遺傳學(xué)方法發(fā)現(xiàn)，發(fā)生分裂的1PN胚胎中80%為二倍體，12% 為單倍體，7% 為三倍體［7］。另外，F(xiàn)eng［25］和Levron等［6］在研究中也發(fā)現(xiàn)，在 IVF周期中，50%的1PN受精卵都含有Y染色體，表明其不是孤雌激活形成的［6］，而分裂后形成的1PN胚胎經(jīng)細(xì)胞遺傳學(xué)檢測(cè)，也發(fā)現(xiàn)通常為二倍體，提示受精正常。

ICSI-1PN與IVF-1PN的染色體組成有所不同。Catherine Staessen等［30］研究顯示IVF-1PN來(lái)源的胚胎中48.7%為二倍體，ICSI-1PN來(lái)源的胚胎中27.9%為二倍體，提示 IVF-1PN胚胎的二倍體率高于 ICSI-1PN，作者認(rèn)為導(dǎo)致這一現(xiàn)象的原因可能是部份卵子受精后原核形成不同步或是已經(jīng)發(fā)生原核融合。Sultan等［7］報(bào)道ICSI-1PN來(lái)源的胚胎中9.5%為二倍體，66.7%為單倍體。

盡管國(guó)內(nèi)外有不少數(shù)學(xué)者研究了1PN胚胎的非整倍體發(fā)生情況［31］，但對(duì)是否選擇其進(jìn)行移植一直是廣大學(xué)者爭(zhēng)論的焦點(diǎn)。有學(xué)者認(rèn)為，1PN胚胎為伴有染色體異常的異常受精胚胎，不適合移植。含有單倍體遺傳物質(zhì)的胚胎一般不會(huì)繼續(xù)發(fā)育或者發(fā)育不正常，即使將其進(jìn)行移植，也多會(huì)發(fā)生流產(chǎn)、死胎、發(fā)育停止等。還有學(xué)者認(rèn)為1PN來(lái)源胚胎發(fā)育潛能有限。Balakier等［32］在研究中發(fā)現(xiàn)，許多1PN胚胎質(zhì)量較差，伴有碎片或者在2或8細(xì)胞階段發(fā)育停滯，只有30%左右的胚胎發(fā)育至桑椹胚或者囊胚階段，胚胎的囊胚形成率極低，故認(rèn)為移植1PN來(lái)源胚胎沒有臨床意義，建議不移植。也有學(xué)者持相反意見，Katie Feenan 等［1］認(rèn)為，部分 1PN 胚胎可培育至囊胚［14］，近年來(lái)有研究者從1PN胚胎成功地培育出了46，XX核型的人類胚胎干細(xì)胞系，以及1PN胚胎出生的健康新生兒［7，12-14］，以上幾點(diǎn)支持了1PN胚胎作為無(wú)其他可選胚胎進(jìn)行移植的情況下作為備選胚胎的可行性。

2.3 0PN發(fā)生機(jī)制及國(guó)內(nèi)外研究進(jìn)展 約30% ～40%的卵子體外受精18～20 h后顯微鏡下觀察未見原核。未見到原核并不意味著未發(fā)生受精現(xiàn)象，繼續(xù)觀察后發(fā)現(xiàn)，部分0PN卵子仍會(huì)卵裂形成胚胎，其外觀形態(tài)、卵裂率與正常受精胚胎相似。發(fā)生卵裂的原因可能是孤雌激活或者正常受精。IVF授精后可出現(xiàn)0PN的卵子，其中大約20%可發(fā)育成形態(tài)正常的胚胎［1］。

0PN的形成機(jī)制可能包括以下幾個(gè)方面:①受精缺陷:最常見的發(fā)生原因是精子黏附和穿透機(jī)制的缺陷，或透明帶受體的缺乏使精子的穿透受到抑制，精子不能穿入卵子內(nèi)造成受精失敗［14］;②正常受精，只是雌雄兩原核發(fā)育不同步，原核提前融合而過早消失，或者原核形成延遲，導(dǎo)致鏡下未見到原核。③Malcov等［5］通過熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH)和多態(tài)標(biāo)志分析發(fā)現(xiàn)4個(gè)0PN1PB胚胎中2個(gè)為二倍體雙雌胚胎(digynic embryo)，其機(jī)制可能是第二極體未分裂出來(lái)，而是參與到核遺傳物質(zhì)的形成當(dāng)中。

在臨床實(shí)踐中，因顯微鏡下觀察時(shí)未見到原核，對(duì)0PN胚胎的染色體組成存在疑問，為了避免移植染色體異常胚胎而常將此類胚胎廢棄，造成了胚胎的浪費(fèi)。在患者無(wú)可選正常受精胚胎移植時(shí)，此類胚胎顯得尤為重要。Manor等［6］采用FISH方法分析了23個(gè)0PN胚胎的 13、18、2l、X、Y 染色體的非整倍體性，發(fā)現(xiàn)57%(13/23)0PN胚胎為二倍體胚胎，提示為正常受精，將6個(gè)這樣的胚胎移植給3個(gè)婦女，1例獲得正常妊娠。

3 對(duì)1PN及0PN胚胎研究的趨勢(shì)

從理論上講，2PN胚胎為正常的二倍體核型，但有學(xué)者通過研究發(fā)現(xiàn)正常受精的分裂期胚胎中有25%～40%的染色體核型異常，卵裂期發(fā)育延緩的2PN胚胎染色體異常的發(fā)生率更高［33］。因此，對(duì)于0PN及1PN這類肉眼觀察為異常受精的胚胎，可提高選擇的標(biāo)準(zhǔn)，即選擇發(fā)育速度及形態(tài)都正常者進(jìn)行研究，以期最大程度的找出正常受精胚胎的所屬范疇。

具有2PB是卵子完成第二次減數(shù)分裂的標(biāo)志，比1PB卵子二倍體可能性更高［1］，2PB的存在可一定程度上排除二倍體雙雌胚胎的移植。不同原核來(lái)源胚胎的染色體非整倍體發(fā)生率和非整倍體型的分布不同。如果能運(yùn)用FISH等技術(shù)檢測(cè)IVF-ET周期中，源于具有高受精風(fēng)險(xiǎn)患者的發(fā)育及形態(tài)良好1PN或0PN，且具有2PB胚胎的染色體非整倍體分布并判斷其移植價(jià)值，則能更好的為臨床上在無(wú)2PN正常受精胚胎移植的情況下，是否選擇相應(yīng)0PN和/或1PN胚胎移植，以及在存在有發(fā)育速度及狀態(tài)良好的0PN和/或1PN胚胎時(shí)，是否將其凍存以保存患者生殖能力或繼續(xù)培養(yǎng)提供理論依據(jù)，減少周期取消率，提高臨床妊娠率，更好的為病人進(jìn)行治療。

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