漢防己甲素抑制人工晶狀體前膜形成的實(shí)驗(yàn)研究

陳學(xué)國(guó)，田學(xué)敏，鄒 倩，曹小勇，張百珂

(解放軍第153中心醫(yī)院眼科 河南 鄭州 450042)

人工晶狀體前膜是白內(nèi)障摘除及后房型人工晶狀體植入術(shù)后一種嚴(yán)重的早期并發(fā)癥。目前治療的主要藥物是皮質(zhì)類固醇。但它的副作用限制了其臨床應(yīng)用。本研究觀察漢防己甲素對(duì)人工晶狀體前膜形成的影響。

1 材料和方法

1.1 一般資料 選擇日本大耳白兔36只，年齡4～6月;體重(2.76±0.43)kg。5號(hào)針頭自角膜緣穿刺進(jìn)入前房，劃破晶狀體前囊約5 mm長(zhǎng)，做成雙眼外傷性白內(nèi)障模型。外傷性白內(nèi)障3 d后，剪開(kāi)結(jié)膜，角膜緣后做鞏膜板層切口，刺入前房，分離虹膜后粘連，截囊，水解晶狀體核，擴(kuò)大切開(kāi)，取出晶狀體核，抽凈皮質(zhì)。植入后房型人工晶狀體于囊袋內(nèi)或睫狀溝內(nèi)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及處理 隨機(jī)分為3組，每組12只。漢防己甲素組、地塞米松組和空白對(duì)照組分別結(jié)膜下注射漢防己甲素注射液5 mg(0.5 ml)、地塞米松注射液2 mg(0.5 ml)和生理鹽水注射液 0.5 ml，每日1 次，共7 d。

1.3 實(shí)驗(yàn)指標(biāo)測(cè)定 術(shù)后第3、5、7天裂隙燈顯微鏡下房水閃光分級(jí)［1］。術(shù)后第 3、7、14、28 天，裂隙燈顯微鏡下檢查人工晶狀體前膜的形成情況并分級(jí)［2］。術(shù)后第1、3、7、14 天抽取0.2 ml房水。將所得房水注入血細(xì)胞計(jì)數(shù)板的計(jì)數(shù)池中1滴，計(jì)數(shù)房水細(xì)胞總數(shù)。余離心后吸取沉淀物制成厚膜涂片，行瑞氏姬姆薩聯(lián)合染色，鏡檢，計(jì)數(shù)并分類［3］。離心后上清液稀釋2倍約0.3 ml，其中 0.2 ml稀釋上清液加入丙二醛(MDA)測(cè)定試劑中，95℃水浴40 min，然后以4 000 r/min離心10 min，上清液用721型分光光度儀在532 nm處比色，得吸光值。通過(guò)樣品含量=(測(cè)定管吸光度－測(cè)定空白管吸收光度)/(標(biāo)準(zhǔn)吸光度－標(biāo)準(zhǔn)空白管吸光度)×2×10 nmol/ml，得出房水中MDA含量。其余稀釋上清液再稀釋10倍后取0.1 ml加入考馬斯亮蘭G250染色液中，混勻后在室溫中放置15 min，用721型分光光度儀在595 nm處比色測(cè)定吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線中查出相應(yīng)的蛋白質(zhì)含量。

1.4 人工晶狀體病理檢查 術(shù)后第7、28天，處死實(shí)驗(yàn)兔，切取角膜并摘出人工晶狀體。角膜迅速用0.25%臺(tái)盼蘭染液和0.2%茜素紅染液聯(lián)合染色共3～4 min，用生理鹽水沖洗掉染料，鏡檢，計(jì)數(shù)內(nèi)皮細(xì)胞密度。第7、28天每組各取出2枚人工晶狀體，立即放入2.5%中性戊二醛固定溶液中固定8 h，磷酸緩沖液漂洗，乙醇梯度脫水，CO2臨界點(diǎn)干燥，裝臺(tái)，樣品處理儀上濺射金膜及導(dǎo)電處理，上掃描電鏡觀察。

取出的其余人工晶狀體立即固定于Bouin液中，行HE染色，觀察人工晶狀體表現(xiàn)細(xì)胞及前膜形成情況。人工晶狀體表現(xiàn)分成4個(gè)象限，每個(gè)象限隨機(jī)計(jì)數(shù)兩個(gè)高倍視野，計(jì)數(shù)細(xì)胞總數(shù)并分類［4］。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS13.0軟件包，前房水渾濁程度及人工晶狀體前膜形成程度用成組設(shè)計(jì)多樣本秩和檢驗(yàn)和兩兩比較的秩和檢驗(yàn);房水細(xì)胞數(shù)、人工晶狀體表面細(xì)胞總數(shù)、角膜內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)、蛋白質(zhì)和丙二醛含量用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，選用方差分析和多樣本均數(shù)兩兩比較q檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 房水閃光分級(jí) 術(shù)后第3天漢防己甲素組與地塞米松組之間比較差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。術(shù)后第5、7天漢防己甲素組與對(duì)照組之間比較差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);地塞米松組與對(duì)照組之間比較差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);而漢防己甲素組與地塞米松組之間比較差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

2.2 人工晶狀體前膜 人工晶狀體前膜術(shù)后第1天不明顯，第3天開(kāi)始出現(xiàn)至28天顯著。第3、7、14、28天漢防己甲素組、地塞米松組與對(duì)照組之間比較差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。漢防己甲素組人工晶狀體前膜輕于地塞米松組，但兩兩比較結(jié)果顯示兩組間比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

2.3 房水細(xì)胞計(jì)數(shù)及分類 漢防己甲素組、地塞米松組房水細(xì)胞總數(shù)明顯低于對(duì)照組(P＜0.01);漢防己甲素組與地塞米松組相似(P＞0.05)。第1天以中性粒細(xì)胞為主，第3天后變?yōu)橐跃奘杉?xì)胞為主。

2.4 房水蛋白質(zhì)含量和房水丙二醛含量 漢防己甲素組與地塞米松組房水蛋白質(zhì)含量明顯低于對(duì)照組(P＜0.01);漢防己甲素組與地塞米松組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。漢防己甲素組、地塞米松組房水丙二醛含量明顯低于對(duì)照組(P＜0.01);漢防己甲素組與地塞米松組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

2.5 人工晶狀體表面細(xì)胞、角膜內(nèi)皮細(xì)胞密度分析結(jié)果及人工晶狀體表面光鏡及電鏡檢查結(jié)果 人工晶狀體表面主要由巨噬細(xì)胞和成纖維細(xì)胞組成。漢防己甲素組、地塞米松組人工晶狀體表面巨噬細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、異物巨細(xì)胞明顯低于對(duì)照組(P＜0.01);漢防己甲素組與地塞米松組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。漢防己甲素組、地塞米松組與對(duì)照組角膜內(nèi)皮細(xì)胞密度基本一致，比較差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。對(duì)照組人工晶狀體表面可見(jiàn)大量且較厚的纖維蛋白膜。膜中間摻雜有大量的細(xì)胞成分，以巨噬細(xì)胞為主。巨噬細(xì)胞胞呈高活化狀態(tài)。漢防己甲素組人工晶狀體表面纖維蛋白膜較少且菲薄，細(xì)胞成分小，以巨噬細(xì)胞為主，呈非活化狀態(tài)。地塞米松組同漢防己甲素組相似。

3 討論

3.1 漢防己甲素的抗炎、抗氧化作用 漢防己甲素是由防己科植物防己中提取的雙芐基異喹啉類生物堿。含有多個(gè)烷氧基。對(duì)炎癥的多個(gè)環(huán)節(jié)有抑制作用［5］。本研究發(fā)現(xiàn)，術(shù)后房水中有大量的白細(xì)胞聚集。第1天以中性粒細(xì)胞為主，術(shù)后第1～14天隨時(shí)間推移白細(xì)胞數(shù)逐漸減少，而單核巨噬細(xì)胞數(shù)逐斷增多。漢防已甲素組和地塞米松組術(shù)后細(xì)胞總數(shù)、嗜中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)明顯低于對(duì)照組(P＜0.05)，漢防已甲素組與地塞米松組相比差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，提示漢防已甲素能夠廣泛抑制術(shù)后房水中各種類型的白細(xì)胞聚集，無(wú)明顯特異性，且與地塞米松作用相似。漢防已甲素組的蛋白質(zhì)含量明顯減少，與對(duì)照組相比差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.01)，提示漢防已甲素能夠減輕血－房水屏障的紊亂和降低炎癥反應(yīng)的程度。本研究發(fā)現(xiàn)，術(shù)后各組房水中丙二醛的含量隨著損傷的修復(fù)而逐漸減少。漢防己甲組丙二醛的含量明顯少于對(duì)照組(P＜0.01)。表明漢防已甲素明顯抑制術(shù)后前房中脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，減輕眼局部組織損傷，因而對(duì)術(shù)后眼組織產(chǎn)生保護(hù)作用。

3.2 漢防已甲素抑制人工晶狀體表面細(xì)胞反應(yīng)的作用 白內(nèi)障摘除人工晶狀體植入術(shù)后，人工晶狀體表面出現(xiàn)一系列細(xì)胞反應(yīng)。漢防己甲素具有免疫抑制作用，主要對(duì)遲發(fā)型過(guò)敏反應(yīng)好發(fā)生和慢性肉芽腫性炎形成中起關(guān)鍵作用的巨噬細(xì)胞和細(xì)胞因子起作用。能明顯降低白介素-1和α－轉(zhuǎn)化因子的mRNA的表達(dá)水平，阻滯其合成。并且抑制單核細(xì)胞的增生和白介素-2、白介素-4和γ-干擾素的產(chǎn)生，抑制巨噬細(xì)胞的活化，降低其氧耗量，抑制其呼吸爆發(fā)的過(guò)程［6］。本實(shí)驗(yàn)人工晶狀體植入術(shù)后，其表面發(fā)生巨噬細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、異物巨細(xì)胞、超大巨細(xì)胞和淋巴細(xì)胞參與的細(xì)胞反應(yīng)，以巨噬細(xì)胞為主，早期尚有中性粒細(xì)胞參與。吞噬細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)吞噬較多的顆粒，表面突起多，微絨毛豐富，可謂高活化狀態(tài)。超大巨細(xì)胞、異物巨細(xì)胞表面均有大量巨噬細(xì)胞粘附，并有融合趨勢(shì)。局部應(yīng)用漢防已甲素后人工晶狀體表面巨噬細(xì)胞、異物巨細(xì)胞、成纖維細(xì)胞數(shù)均明顯少于對(duì)照組，巨噬細(xì)胞呈非活化狀態(tài)，異物巨細(xì)胞、超大巨細(xì)胞表面突起少，提示局部應(yīng)用漢防已甲素可顯著減輕人工晶狀體表面細(xì)胞反應(yīng)，抑制細(xì)胞的活性，并且抑制巨噬細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、異物巨細(xì)胞、超大巨細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，阻斷其演變過(guò)程，從而達(dá)到抑制人工晶狀體表面細(xì)胞反應(yīng)的目的。

3.3 漢防已甲素對(duì)人工晶狀體前膜的抑制作用 人工晶狀體前膜的形成是多因素參與或介導(dǎo)的結(jié)果。與術(shù)后炎癥反應(yīng)、免疫反應(yīng)和細(xì)胞增生等多種因素有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，人工晶狀體植入術(shù)后，均發(fā)生不同程度的炎癥反應(yīng)，主要以細(xì)胞聚集和蛋白質(zhì)滲入為主，3 d就形成Ⅱ級(jí)人工晶狀體前膜的實(shí)驗(yàn)兔，其術(shù)后炎癥反應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)，人工晶狀體表面可見(jiàn)大量細(xì)胞沉積 ，且細(xì)胞成高活化狀態(tài)。局部應(yīng)用漢防已甲素后，炎癥明顯減輕，人工晶狀體表面增生減弱，細(xì)胞呈非活化狀態(tài)，人工晶狀體前膜與空白對(duì)照組比較差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.01)?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，漢防己甲素既是一種Ca2+通道阻滯劑，又是鈣調(diào)蛋白拮抗劑。推測(cè)漢防己甲素抑制人工晶狀體抑制人工晶狀體前膜的機(jī)制為:①抑制了術(shù)后眼內(nèi)炎癥反應(yīng)。②抑制了術(shù)后眼內(nèi)免疫反應(yīng)。③抑制了成纖維細(xì)胞的增生［7］。值得提出的是，漢防已甲素抑制人工晶狀體前膜的程度與地塞米松作用相似(P＞0.05)，但由于漢防已甲素?zé)o明顯毒副作用，可長(zhǎng)期使用［8，9］，因而可認(rèn)為漢防已甲素可能成為一種很有前途的抑制人工晶狀體前膜的藥物。

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