桔梗根的水提取物對(duì)腫瘤侵潤(rùn)和轉(zhuǎn)移的抑制作用

畢承華

桔梗是中國(guó)傳統(tǒng)的草藥，它的免疫刺激效果和抗腫瘤效果是眾人皆知的。Lee用體外和體內(nèi)腫瘤轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)檢驗(yàn)了桔梗根水提取物的抗腫瘤轉(zhuǎn)移活性［1］。CK通過(guò)一個(gè)再生的基底細(xì)胞膜抑制了B16-F10黑色素瘤細(xì)胞，并強(qiáng)烈抑制B16-F10黑色素瘤細(xì)胞黏附到細(xì)胞外基質(zhì)，例如基質(zhì)膠，纖維結(jié)合蛋白和層粘連蛋白底物。CK也抑制了實(shí)驗(yàn)性肺癌并延長(zhǎng)了體內(nèi)幸存時(shí)間。除此之外，CK擴(kuò)大了NK細(xì)胞活性。這些結(jié)果表明了CK可能通過(guò)抑制腫瘤細(xì)胞黏附到基底細(xì)胞膜和激活NK細(xì)胞而減少B16-F10黑色素瘤細(xì)胞肺轉(zhuǎn)移的程度。

桔梗的根既可食用又可作為傳統(tǒng)的藥物治療成年疾病，例如支氣管炎、哮喘、肺結(jié)核、高脂血癥和炎性疾病，也作為鎮(zhèn)靜劑使用。近來(lái)，有人工栽培20年的桔梗中提取的成分changkil(CK)在大鼠身上具有抗氧化、保肝和阻止肝纖維化作用的報(bào)道。除此之外，通過(guò)Toll-like4受體樣作用它也可以激活巨噬細(xì)胞。雖然CK通過(guò)調(diào)控巨噬細(xì)胞功能具有擴(kuò)大免疫反應(yīng)的作用，但是細(xì)胞介導(dǎo)的精確免疫擴(kuò)增機(jī)制卻是不清楚的。此外，CK其他的生物學(xué)特性，例如對(duì)于腫瘤入侵和轉(zhuǎn)移的影響尚不清楚。經(jīng)過(guò)以下研究，除調(diào)查CK的抗腫瘤活性，關(guān)于瘤轉(zhuǎn)移的治療抑制作用之外，還分析了CK抗瘤轉(zhuǎn)移效應(yīng)的機(jī)制，探討CK是否通過(guò)激活自然殺傷細(xì)胞而增強(qiáng)了宿主防御系統(tǒng)抑制腫瘤。這項(xiàng)結(jié)果在于證明其在小鼠實(shí)驗(yàn)中有重要的抗轉(zhuǎn)移活性［2］。

1 實(shí)驗(yàn)研究

采用每分轉(zhuǎn)數(shù)為1640的介質(zhì)培養(yǎng)基和購(gòu)置的胎牛血清、從分子探針技術(shù)中得到的鈣黃綠素-AM，制備了22年生桔梗根的水提取物進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)研究。方法是，向蒸餾水中加入粉末狀根(5 ml/g)，該混合物在90℃保持10 h，冷卻至室溫，然后濾過(guò)和低壓凍干，吸收率約是33.5%(每100 g原干燥根中含有33.5 g剩余殘?jiān)?，將得到的淺黃色水提取物(CK)直接溶解在滅菌生理鹽水中。

采用的動(dòng)物為Dao Han動(dòng)物研究公司提供的5～6周大成年雄性小鼠，用嚙齒類動(dòng)物專用飼料飼養(yǎng)，飲水量不限，飼養(yǎng)環(huán)境為(21±2)℃，(50±5)%相對(duì)濕度，有12 h晝夜交替的條件。

所采用的細(xì)胞株為具有高度侵害和轉(zhuǎn)移能力的鼠類黑色素瘤B16-F10，和鼠類淋巴瘤YAC-1(自然殺傷敏感靶細(xì)胞)，被保存在含 10%FBS，100 μnits/ml青霉素和 100 μg/ml鏈霉素，RPMI1640培養(yǎng)液中，以37℃，含經(jīng)濕化的5%CO2的環(huán)境保存。

應(yīng)用經(jīng)改良的在Transwell細(xì)胞培養(yǎng)真空箱中進(jìn)行的腫瘤細(xì)胞體外侵潤(rùn)分析法檢測(cè)活性。方法為:將8.0 μm孔徑的聚乙烯吡咯烷酮-游離聚碳酸酯過(guò)濾器用500 μg/ml的基質(zhì)膠包埋后置Transweil真空室內(nèi)。過(guò)濾膜在磷酸鹽緩沖液(pbs)中沖洗后立即干燥。10%FBS-RPMI1640培養(yǎng)液放在室中低位，B16-F10細(xì)胞被放在室中高位。將CK溶液加到高位，在37℃含有5%CO2環(huán)境中培養(yǎng)4 h。通過(guò)0.2%結(jié)晶紫染色計(jì)數(shù)法測(cè)量穿過(guò)PVPF過(guò)濾膜基質(zhì)膠包埋侵潤(rùn)的細(xì)胞數(shù)量。

通過(guò)96孔板，使用以往方法的改良法進(jìn)行細(xì)胞黏附測(cè)定。小孔預(yù)先在室溫下用 50 μl，15 μg/ml纖維結(jié)合素，10 μg/ml基質(zhì)膠，或 50 μl，40 μg/ml層黏連蛋白包埋，然后用0.2 mlRPMI1640/well(包含3%BSA)，培養(yǎng)液在37℃密封1 h。把細(xì)胞放在RPMI1640(包含0.1%BAS)培養(yǎng)液中重新懸浮，加入每個(gè)孔池中(5×105/ml)，然后加入CK，充分反應(yīng)。將該混懸液在37℃下培養(yǎng)1 h。小孔池用加熱的磷酸鹽緩沖液(pbs)沖洗兩次以除去未反應(yīng)的細(xì)胞，已反應(yīng)的細(xì)胞在20%甲醇中用0.2%龍膽紫水溶液染色10 min。細(xì)胞染色后，立即在200 μl1%十二烷基磺酸鈉中溶解，光密度在560 nm用(microplate reader)全自動(dòng)定量繪圖酶標(biāo)儀可以測(cè)量。

進(jìn)行了細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)，用WST-1細(xì)胞計(jì)數(shù)器測(cè)定細(xì)胞生長(zhǎng)的水平。簡(jiǎn)言之，把10%FBS-RPMI1640培養(yǎng)液中的B16-F10細(xì)胞分放在有96個(gè)小孔池中，培養(yǎng)24 h后，把各種不同濃度的CK加到池中，37℃下再培養(yǎng)24 h。鹽酸阿霉素用于抑制對(duì)照。把10 μl WST-1溶液加入到每個(gè)孔池中，在37℃下培養(yǎng)4 h，然后結(jié)束實(shí)驗(yàn)。450 nm處的吸光度可以用(microplate reader)全自動(dòng)定量繪圖酶標(biāo)儀測(cè)定。

1.1 實(shí)驗(yàn)性肺轉(zhuǎn)移體內(nèi)測(cè)定 采集B16-F10對(duì)數(shù)生長(zhǎng)細(xì)胞，用無(wú)血清RPMI1640培養(yǎng)液清洗，混懸，使其在磷酸鹽緩沖液中具有適宜的濃度。將C57BL/6小鼠隨機(jī)分成3組，每組有12只，3個(gè)組均尾靜脈注射B16-F10細(xì)胞混懸液，每次0.2 ml(5×105)。將CK混懸于滅菌生理鹽水中，然后用這種轉(zhuǎn)移誘導(dǎo)作用以口服方式持續(xù)不斷地喂給小鼠。這種治療持續(xù)7 d。1組僅被注射B16-F10細(xì)胞混懸液所采用的賦形劑，2組與3組分別以20 mg/kg和100 mg/kg劑量注射CK，每天監(jiān)測(cè)動(dòng)物體重，將每組中的6只小鼠注射腫瘤細(xì)胞14 d后處死，將肺臟保存于Bouin's溶液(苦味酸∶20%福爾馬林中性緩沖液∶乙酸=15∶5∶1)中。用立體解剖顯微鏡觀察每組小鼠肺表面的B16-F10菌群數(shù)量，測(cè)定它們的存活率。需監(jiān)測(cè)存活率兩個(gè)月以上。

1.2 脾淋巴細(xì)胞的分離 將CK放在滅菌生理鹽水中混懸并以口服方式喂小鼠3 d。該分離方法為以往常用的方法。細(xì)胞的成活率總是大于90%。

1.3 自然殺傷細(xì)胞活性實(shí)驗(yàn) NK細(xì)胞活性可以通過(guò)形成鈣黃綠素-Am釋放分析來(lái)測(cè)定，這種方法是對(duì)曾報(bào)道過(guò)方法的改良。用10 μg/ml的鈣黃綠素在游離血清-培養(yǎng)液中對(duì)YAC-1細(xì)胞標(biāo)記30 min，用純RPMI1640培養(yǎng)液清洗三次后，把0.1 ml標(biāo)記YAC-1細(xì)胞加到96孔板中。將效應(yīng)器細(xì)胞，脾淋巴細(xì)胞(0.1 ml)加到每個(gè)小孔池中來(lái)產(chǎn)生各種效應(yīng)因子/靶因子比例，小孔板在37℃下培養(yǎng)4個(gè) h，離心后，移除0.1 ml游離細(xì)胞上清液，用熒光光度計(jì)測(cè)量上清液的熒光強(qiáng)度，其在500nm有最大吸光強(qiáng)度，540 nm有最大發(fā)光強(qiáng)度。特有的細(xì)胞溶解活性按照如下方法計(jì)算:百分細(xì)胞溶解活性=(E-S)(T-S)×100(E是靶細(xì)胞和效應(yīng)細(xì)胞的熒光吸收強(qiáng)度，S僅是靶細(xì)胞的熒光發(fā)射強(qiáng)度，T是總的熒光強(qiáng)度)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間差異用方差分析表，檢驗(yàn)是否兩組間存在較大的偏差，Dunnet檢驗(yàn)用于比較兩組之間的平均值。余下數(shù)據(jù)用Fisher精密度檢驗(yàn)和卡普蘭-邁耶生存曲線進(jìn)行分析。若P＜0.01則在差異上有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.5 實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下 CK在腫瘤細(xì)胞侵潤(rùn)方面的作用具有高侵潤(rùn)和轉(zhuǎn)移能力的鼠類黑色素瘤細(xì)胞群(B16-F10)進(jìn)行體外侵潤(rùn)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，在Transwell細(xì)胞培養(yǎng)室中CK對(duì)侵潤(rùn)重建基底膜(基質(zhì)膠)的B16-F10細(xì)胞有抑制作用。CK抑制B16-F10細(xì)胞侵潤(rùn)基質(zhì)膠/纖維結(jié)合蛋白-包埋過(guò)濾膜的作用呈現(xiàn)濃度依賴方式，濃度約為20 μg/ml的CK濃度可以抑制50%細(xì)胞。

CK在腫瘤細(xì)胞與ECM黏附方面的作用可以測(cè)定出CK對(duì)B16-F10細(xì)胞黏附ECM組分的作用，因?yàn)槟[瘤細(xì)胞與ECM的黏附作用是腫瘤侵潤(rùn)作用中最基本的一步。將B16-F10細(xì)胞用濃度1～100 μg/mlCK進(jìn)行處理，CK可以抑制B16-F10黑色素瘤細(xì)胞與基質(zhì)膠(IC50=43 μg/ml)和纖維結(jié)合蛋白(IC50=62 μg/ml)黏附，該作用是呈現(xiàn)濃度依賴方式。CK強(qiáng)烈地抑制B16-F10細(xì)胞與層黏連蛋白結(jié)合，濃度是31 μg/ml的CK呈現(xiàn)最大抑制細(xì)胞黏附作用。在下面一系列的實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步測(cè)定了CK抑制B16-F10細(xì)胞與層黏連蛋白底物結(jié)合的機(jī)制。用濃度為1-100 μg/mlCK在冰上培養(yǎng)B16-F10細(xì)胞1 h，然后用磷酸鹽緩沖溶液(PBS)培養(yǎng)。在另外的實(shí)驗(yàn)中，包埋的層黏連蛋白底物在37℃下培養(yǎng)3 h，用PBS液清洗。表明CK阻礙B16-F10細(xì)胞與層黏連蛋白黏附呈現(xiàn)濃度依賴的方式。然而，用CK對(duì)底物沒(méi)有這樣的抑制作用。

CK對(duì)B16-F10黑色素瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性效應(yīng)WST分析以檢測(cè)CK的抗黏附作用是否由基于細(xì)胞毒性的假陽(yáng)性作用引起。CK在1-100 μg/ml范圍內(nèi)無(wú)影響對(duì)B16-F10細(xì)胞24 h培養(yǎng)中的生長(zhǎng)。另一方面，鹽酸阿霉素作為陽(yáng)性對(duì)照，對(duì)體外細(xì)胞生長(zhǎng)有潛在的抑制作用。CK濃度超過(guò)800 μg/ml顯示有輕細(xì)胞毒性作用(數(shù)據(jù)沒(méi)有表明)。這些結(jié)果說(shuō)明CK對(duì)腫瘤細(xì)胞黏附和侵潤(rùn)作用不是由于CK的細(xì)胞毒性作用。

2 CK對(duì)肺轉(zhuǎn)移和存活率的影響

因?yàn)樯厦娴慕Y(jié)果闡釋CK在體外實(shí)驗(yàn)中對(duì)腫瘤侵潤(rùn)有顯著的抑制作用，這項(xiàng)研究檢測(cè)CK在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)對(duì)肺轉(zhuǎn)移的影響，通過(guò)給C57BL/6小鼠靜脈注射B16-F10黑色素瘤細(xì)胞產(chǎn)生肺轉(zhuǎn)移酶，結(jié)果顯示用CK處理過(guò)的小鼠肺轉(zhuǎn)移酶數(shù)量與未處理的比較呈現(xiàn)CK濃度依賴型減少。尤其，用100 mg/kg濃度CK處理小鼠可以抑制65%的肺轉(zhuǎn)移數(shù)量。在這個(gè)劑量下，不但對(duì)小鼠體重沒(méi)有影響，也沒(méi)有任何其他毒性臨床癥狀。這些結(jié)果闡釋了CK口服有劑量依賴型抗轉(zhuǎn)移活性。100 mg/kg劑量處理小鼠后存活期高于對(duì)照組二倍多。

2.1 CK對(duì)體內(nèi)NK細(xì)胞活性的影響 CK對(duì)先天宿主反應(yīng)的作用機(jī)制可被檢測(cè)，尤其是NK細(xì)胞擴(kuò)增，因?yàn)橥瑫r(shí)給與CK在阻止腫瘤轉(zhuǎn)移是有效的。NK細(xì)胞的擴(kuò)增表明具有抑制瘤轉(zhuǎn)移的作用。在此項(xiàng)研究中，CK連續(xù)3 d給藥后，用脾淋巴細(xì)胞作效應(yīng)細(xì)胞，YAC-1細(xì)胞做靶細(xì)胞檢測(cè)一天NK細(xì)胞的活性。結(jié)果表示CK以劑量依賴的方式顯著的提高脾NK細(xì)胞活性。脾淋巴細(xì)胞活性被增加的同時(shí)，注射CK 3 d后NK細(xì)胞活性達(dá)到最高。因此，CK可以激活體內(nèi)NK細(xì)胞的活性。該研究表明CK以劑量依賴的方式較強(qiáng)地抑制肺轉(zhuǎn)移，肺轉(zhuǎn)移由注射B16-F10黑色素瘤細(xì)胞產(chǎn)生。

3 結(jié)論

腫瘤細(xì)胞侵潤(rùn)細(xì)胞外基質(zhì)是瘤轉(zhuǎn)移過(guò)程中重要的一步。細(xì)胞外基質(zhì)蛋白質(zhì)通過(guò)與細(xì)胞表面受體結(jié)合促進(jìn)細(xì)胞黏附。這個(gè)研究表明使用重建基底膜(體外基質(zhì)膠)，CK可以抑制B16-F10細(xì)胞侵潤(rùn)。一項(xiàng)體外黏附實(shí)驗(yàn)說(shuō)明CK成功地阻礙了B16-F10黑色素瘤細(xì)胞黏附于細(xì)胞外基質(zhì)蛋白質(zhì)，例如基質(zhì)膠，纖維結(jié)合蛋白和層黏連蛋白，該一致作用呈現(xiàn)濃度依賴的方式。用CK短期預(yù)處理B16-F10細(xì)胞可阻礙細(xì)胞黏附于層黏連蛋白，該事實(shí)說(shuō)明抑制細(xì)胞黏附于層黏連蛋白底物與CK和腫瘤細(xì)胞表面結(jié)合有關(guān)而并非與層黏連蛋白底物有關(guān)。然而，詳細(xì)的機(jī)制仍不清楚。一個(gè)可能的解釋是CK與層黏連蛋白的受體(例如在腫瘤細(xì)胞表面的一種抗抑郁藥)結(jié)合，這種結(jié)合使CK抑制了腫瘤細(xì)胞的黏附與侵潤(rùn)。24 h的培養(yǎng)過(guò)程中，CK在研究所使用的濃度下未顯示任何的細(xì)胞毒性反應(yīng)。這表明CK的抗黏附和抗侵潤(rùn)作用不是由于細(xì)胞毒性產(chǎn)生的。許多報(bào)道說(shuō)明生物活性化合物的抗腫瘤活性通過(guò)刺激免疫系統(tǒng)與不同的源物質(zhì)分離開來(lái)。從當(dāng)歸屬中分離出來(lái)的當(dāng)歸和青牛膽屬考狄葉素增強(qiáng)了B16-F10黑色素瘤細(xì)胞植入小鼠的免疫功能，并增加了這些鼠的生存率，同時(shí)也抑制了細(xì)胞瘤轉(zhuǎn)移。Song報(bào)道了人參的免疫刺激和抗腫瘤作用［3］。這些報(bào)道表明來(lái)自天然資源的免疫刺激活性物質(zhì)是研發(fā)抗腫瘤藥物很好的候選物質(zhì)。許多實(shí)驗(yàn)和臨床研究表明先天免疫性在免疫監(jiān)視和阻斷原發(fā)腫瘤轉(zhuǎn)移中起著重要的作用。體外長(zhǎng)期和短期實(shí)驗(yàn)都表明CK既不會(huì)對(duì)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生毒性也不會(huì)抑制細(xì)胞增殖。這些結(jié)果也暗示在減少CK處理過(guò)動(dòng)物瘤轉(zhuǎn)移過(guò)程中，也涉及到了免疫系統(tǒng)。進(jìn)一步講，腫瘤減少也可能是通過(guò)β-細(xì)胞或非特異性免疫細(xì)胞(例如NK細(xì)胞)介導(dǎo)的，因?yàn)镃K選擇性的激活B細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，但不能激活T細(xì)胞。這些結(jié)果說(shuō)明，CK可能調(diào)節(jié)了先天宿主防御系統(tǒng)機(jī)制。除此之外，對(duì)抗腫瘤自然免疫系統(tǒng)相關(guān)的效應(yīng)器也被確認(rèn)為是NK細(xì)胞。實(shí)際上，許多研究者已經(jīng)報(bào)道了免疫興奮劑激活NK細(xì)胞導(dǎo)致腫瘤轉(zhuǎn)移減少。事實(shí)上，腫瘤發(fā)病率和轉(zhuǎn)移在小鼠身上是高發(fā)的。除此之外，據(jù)報(bào)道鄰-半乳糖?；拾贝伎梢栽黾芋w內(nèi)NK細(xì)胞的數(shù)量，也可以抑制腫瘤轉(zhuǎn)移酶。因此，更有效力的NK擴(kuò)增劑具有潛在的抗腫瘤活性，但是目前適合的分子靶點(diǎn)還沒(méi)有確定。因此，這項(xiàng)研究依據(jù)NK細(xì)胞的激活作用分析了CK抑制瘤轉(zhuǎn)移的機(jī)制。CK顯著地增強(qiáng)了體內(nèi)NK的活性。

總之，Lee的實(shí)驗(yàn)證明了CK在體外和體內(nèi)均顯示出了抗瘤轉(zhuǎn)移效應(yīng)［3］。這些結(jié)果表明CK的抗轉(zhuǎn)移活性可能是由于阻斷了NK細(xì)胞抗癌時(shí)的黏附和擴(kuò)增。但是CK抗腫瘤活性是否是由于在體內(nèi)阻斷了一種抗抑郁藥integrin介導(dǎo)的黏著作用需要更進(jìn)一步的研究。CK對(duì)于改善腫瘤侵潤(rùn)和尋找轉(zhuǎn)移治療方法可能會(huì)提供一個(gè)潛在的平臺(tái)，它尤其適合于手術(shù)后腫塊的清除和癌癥的復(fù)發(fā)治療。

［1］Lee，E.B.，1973.Phanmacological studies on Platycodon grandiforum A.DC.IV.A comparison of experimental pharmacological efxcts of crude platycodin with clinical indications of piatycodi radix.Yak-ugaku Zasshi93，1188-1194.

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