快速石蠟切片技術(shù)在病理檢驗中的應(yīng)用

金銀姬，陳立本，劉曉慶，馮小宇

（北京市獸醫(yī)實驗診斷所，北京100101）

在日常病理檢驗工作中，隨著臨床對病理報告及時性的要求越來越高，目前有許多病理實驗室在嘗試將病理報告周期由原來3d縮短到1d［1］。但這項工作受診斷者的技術(shù)水平以及取材、制片等因素影響較大。目前，國內(nèi)快速病理診斷多用冷凍切片或傳統(tǒng)加溫快速石蠟切片技術(shù)，但冷凍切片中易出現(xiàn)細胞腫脹等人為假象，傳統(tǒng)的加溫快速石蠟切片制備過程復雜，易造成組織收縮和硬變，將超聲波技術(shù)應(yīng)用于快速病理診斷近年來越來越受到關(guān)注［2］?？焖俨±碓\斷中，制片質(zhì)量和制片速度尤為關(guān)鍵［3］。為解決以上問題，自2010年開始應(yīng)用PPCT-2B超聲波多功能快速組織脫水機摸索制作快速石蠟切片的方法，該方法方便快捷，收到了良好效果，值得將此技術(shù)應(yīng)用和推廣于獸醫(yī)臨床。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標本 用于馬立克病診斷的雞臨床剖檢標本60例（肝、腎、脾、腺胃、卵巢等組織）。

1.1.2 儀器 超聲波多功能快速組織脫水機，包埋機，石蠟切片機，展片機，烤片機，全自動染片機。

1.1.3 試劑 100mL／L AF液（950mL／L酒精9份，400mL／L甲醛1份）；丙酮；石蠟（熔點58℃～60℃）；硬脂酸；HE染色需要的試劑。

1.2 方法

1.2.1 取材固定、脫水透明、浸蠟 先將超聲波快速處理儀開機預熱至72℃［4］。用手術(shù)刀將組織修成1mm～1.5mm左右厚的薄片，放入甲醛固定液內(nèi)處理10min；取出組織，水洗10s，放在濾紙上吸干；放入純丙酮中超聲處理15min，直至組織上浮；放入熔融的石蠟、硬脂酸（石蠟和硬脂酸的比例為3∶1）中20min，漂浮在液體中的組織開始沉底，可用鑷子輕壓組織，直至無氣泡產(chǎn)生。

1.2.2 包埋、切片、染色、封固 常規(guī)包埋和切片。包埋后快速冷卻。切片厚度為3μm～4μm。將切片貼于載玻片后用烤片機加熱烤片10s～15s，烤片溫度不宜超過80℃，更不能將組織烤焦，可邊烤邊用濕布磨擦載玻片反面降溫。

HE染色，用全自動染色機進行，用時43min（2道環(huán)保透明劑各8min；2道1 000mL／L、950mL／L酒精 各1.5min；水洗2min；蘇木素5min；水洗2 min；鹽酸酒精分化10s；水洗2min；伊紅15s；水洗2min；850mL／L、900mL／L、950mL／L、3道1 000 mL／L酒精各1min；3道環(huán)保透明劑各1min），最后用中性樹膠封固。為保證染色的質(zhì)量，不采取快速染色方法。

2 結(jié)果

同時將組織標本作常規(guī)石蠟包埋切片，與快速切片作對比，確定快速診斷的確診率及制片質(zhì)量。結(jié)果表明：鏡下觀察組織結(jié)構(gòu)清楚，細胞形態(tài)完整，胞質(zhì)胞核清晰，切片薄而完整、染色明麗清晰，與常規(guī)切片無明顯差異，時間較常規(guī)石蠟切片縮短3d（圖1～圖4）。

圖1 肝（常規(guī)切片，400×）Fig.1 Liver（Regular section，400×）

圖2 肝（快速切片，400×）Fig.2 Liver（Rapid section，400×）

圖3 腎（常規(guī)切片，200×）Fig.3 Kidney（Regular section，200×）

圖4 腎（快速切片，200×）Fig.4 Kidney（Rapid section，200×）

3 討論

脫水機水槽溫度控制在70℃～72℃，寧低勿高。取材時注意病變的邊緣組織，病變與周圍組織交界處，組織塊要求小而適中［5］。組織的厚薄直接影響脫水時間和效果，組織厚度約1mm，最好不超過1.5mm，寧薄勿厚，如果一定要取一大片，可將該大片分割為數(shù)小片操作［6］。新鮮標本一般難以取薄，所以可先進行初步固定（將10mm×10mm×5mm的組織放入AF液超聲處理1min～2min），初步固定后組織發(fā)硬，較容易取到1mm左右。所有標定的時間為大概的參考基數(shù)，脫水和浸蠟可根據(jù)標本處理程度適當延長或者縮短時間。處理液（AF液，丙酮，石蠟、硬脂酸混合液）要超過標本體積的15倍。脫水一定要干凈，至組織肉眼觀察呈灰白色，質(zhì)較硬為至。富含纖維、脂肪的組織，可適當延長固定脫水時間。碰到脂肪含量比較多的組織建議在無水丙酮前加一道無水乙醇用以脫脂，時間一般2min～3min左右。

標本經(jīng)硬脂酸石蠟混合液處理后，浸蠟均勻充分，標本軟硬適中，比較容易切片，切片厚薄均勻、完整，切片染色良好，與使用二甲苯的切片無明顯差異。用硬脂酸替代二甲苯在病理組織處理中的應(yīng)用，能極大的減輕有毒物質(zhì)對病理技術(shù)人員的危害以及對環(huán)境所造成的影響，同時所制切片質(zhì)量也能得到保證［7］。硬脂酸與石蠟質(zhì)量比例1∶3為宜，硬脂酸濃度不可過高，硬脂酸含量越高越容易掉片，但硬脂酸濃度也不可太低，否則切片透明欠佳［8］。

烤片時先用濾紙吸附殘余液，可縮短烤片時間。超聲快速石蠟切片的優(yōu)越性：組織經(jīng)超聲處理后，既保持了組織的外形和柔韌性，亦無明顯的收縮現(xiàn)象。該技術(shù)制作的切片光鏡下觀察，組織細胞結(jié)構(gòu)更清晰，層次更分明，與常規(guī)制作的切片無明顯差異［9］，大大縮短了制片時間。超聲快速組織脫水機特點：超聲快速脫水機應(yīng)用超聲振蕩和恒溫控制技術(shù)，使組織和有機溶劑或預熔石蠟高速振蕩，產(chǎn)生周期性縮張運動，使組織內(nèi)的水份很快被有機溶劑替代出來，并加速預熔石蠟浸入到組織內(nèi)［10］，從而使固定、脫水、透明、浸蠟全過程能在45min～50min內(nèi)完成，將組織制片的時間極大地縮短。完全能滿足快速病理診斷的要求。

制片質(zhì)量的優(yōu)劣直接影響到病理診斷的準確性，要制作出高質(zhì)量的切片，組織標本處理要適中，力爭做好每一步驟，任何一個環(huán)節(jié)都必須細心和認真，在操作過程中，應(yīng)仔細觀察判斷組織塊的硬度，也是掌握組織處理時間的有效方法［11］。

綜上所述，用超聲處理儀制作快速石蠟切片，可設(shè)定水溫和超聲波大小，簡化了固定脫水程序，進一步縮短了固定、脫水、浸蠟的時間［12］，操作簡單，宜于掌握，不受環(huán)境、氣候和地域等因素的影響，儀器價格適中，而且省時省力，達到了快速診斷的要求。因此，很值得在獸醫(yī)臨床病理診斷上推廣應(yīng)用。

總之，快速石蠟切片作為一種實用技術(shù)，操作簡單，不需要復雜昂貴的儀器設(shè)備，切片鏡檢，組織結(jié)構(gòu)清楚，細胞形態(tài)完整，胞質(zhì)胞核對比好［13］，切片質(zhì)量可與常規(guī)石蠟切片相媲美［14］，提高了工作效率，提供了準確的病理診斷依據(jù)［15］，制片的時間能滿足臨床對快速病理診斷的需要，可在有條件的基層獸醫(yī)機構(gòu)中應(yīng)用。

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