奶牛支原體病的診斷

郭 磊，何生虎＊，邵 倩，楊萌萌，蔣魏娟，安泓霏，付少剛

（1.寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院，寧夏銀川750021；2.銀川市畜牧獸醫(yī)工作站，寧夏銀川750001）

牛支原體（Mycoplasma bovis）是一種能夠?qū)е屡．a(chǎn)生各種各樣疾病和高感染率的的重要病原體。它可以導(dǎo)致牛發(fā)生肺炎、關(guān)節(jié)炎、久治不愈乳腺炎、結(jié)膜角膜炎、懷孕母牛流產(chǎn)、生殖器感染等疾?。?］。發(fā)生牛支原體肺炎影響集約化牛場的生產(chǎn)，且常常由于高病死率、治療昂貴以及病牛生長緩慢而給奶牛養(yǎng)殖企業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失；美國每年由于牛支原體所致的牛乳房炎和呼吸系統(tǒng)疾病造成高達(dá)1.4億美元的損失，單一牛場最高感染率達(dá)70%［2-3］。在我國，1983年黎濟(jì)申首次報(bào)道了從乳房炎牛乳中分離得到牛支原體［4］，此后僅少數(shù)臨床報(bào)道證實(shí)了牛支原體導(dǎo)致奶牛乳房炎；2008年湖北多地報(bào)道了牛支原體可導(dǎo)致肉牛傳染性支原體肺炎［5］，2010年寧夏報(bào)道了肉牛傳染性支原體肺炎［6］。在奶牛方面，國內(nèi)很少見有牛支原體感染的報(bào)道。2011年2月開始，寧夏吳忠某奶牛場中國荷斯坦奶牛出現(xiàn)發(fā)燒、咳嗽、鼻孔流有鐵銹色鼻液、腹瀉、關(guān)節(jié)腫大、蹄部炎癥、嚴(yán)重乳房炎、頭胎牛發(fā)生流產(chǎn)、死胎，新生犢牛在飼喂乳房炎奶牛的乳汁后，逐漸出現(xiàn)關(guān)節(jié)和蹄部腫大（圖1），行走困難，甚至無法站立等癥狀；經(jīng)實(shí)驗(yàn)室診斷，確診為牛支原體和牛無乳支原體混合感染，感染率約為35%，現(xiàn)報(bào)告如下。

圖1 患牛支原體的奶牛關(guān)節(jié)病理變化Fig.1 The pathological lesions in joints of cows infected with Mycoplasma bovis

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料采集 無菌采集病、死奶牛血液、乳汁、鼻及氣管液、肺臟、肝臟、脾臟等。

1.1.2 主要試劑及儀器 新生牛血清購自廣東蕊特生物科技有限公司，酵母粉、瓊脂、水解乳清蛋白粉等均為美國BD公司產(chǎn)品，醋酸鉈為西安市金尊精細(xì)化工有限公司產(chǎn)品，青霉素為河北遠(yuǎn)征藥業(yè)有限公司產(chǎn)品。BIOK-260牛支原體ELISA抗體檢測試劑盒為比利時(shí)BIOK公司產(chǎn)品。Taq DNA聚合酶、pMD18-T為寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品，Primer由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。藥敏片為北京天壇藥物生物技術(shù)開發(fā)公司生產(chǎn)產(chǎn)品，抗生素類產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)：YZB／國1748-2006；喹諾酮類產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)：YZB／國1725-2006。

Biorad-680全自動酶標(biāo)儀，My Cycler PCR儀，均為美國Biorad公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 流行病學(xué)調(diào)查 主要以養(yǎng)牛頭數(shù)、發(fā)病情況、發(fā)病率、病死率、臨床癥狀及病理變化觀察等內(nèi)容為主。

1.2.2 病原體分離培養(yǎng) 將無菌采集發(fā)病奶牛的氣管液、乳汁和關(guān)節(jié)液樣品接種改進(jìn)的Hayflick支原體液體培養(yǎng)基［7］，置37℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)靜置培養(yǎng)4d～6d，待培養(yǎng)基顏色變黃后將培養(yǎng)物連續(xù)傳代。將穩(wěn)定傳代的培養(yǎng)物接種于支原體固體培養(yǎng)基上，置37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2d～6d，待菌落長出后，觀察菌落形態(tài)。

1.2.3 血清學(xué)檢測 按照BIOK-260牛支原體ELISA抗體檢測試劑盒說明書對10頭發(fā)病奶牛采集血清進(jìn)行稀釋、血清轉(zhuǎn)換、反復(fù)沖洗等步驟，制備出試驗(yàn)所需的微量板，配合美國Biorad 680全自動酶標(biāo)儀在450nm波長下讀取每孔的吸光度值，比照BIOK-260牛支原體ELISA抗體檢測試劑盒說明書，計(jì)算出校驗(yàn)值（Val），根據(jù)0（Val＜11.40）、＋（11.40＜Val＜44.64）、＋ ＋ （44.64＜Val＜77.89）、＋＋＋（77.89＜Val＜111.14）、＋＋＋＋（111.14＜Val＜144.39）、＋ ＋ ＋ ＋ ＋ （Val＞144.39）判定樣品陰性或陽性的強(qiáng)弱。

1.2.4 牛支原體PCR檢測

1.2.4.1 支原體核酸的提取 據(jù)文獻(xiàn)提取方法，從固體培養(yǎng)基上將一小塊帶有支原體的菌落挑取加入到150mL滅菌水的離心管中，煮沸10min，之后冰浴1min，12 000r／min離心45s，取上清液作DNA模板。

1.2.4.2 引物的設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道支原體16SrRNA兩端的保守序列、序列特性，設(shè)計(jì)支原體通用引物，通過PCR方法擴(kuò)增培養(yǎng)產(chǎn)物中的16SrRNA［8-9］。

上游引物：5′-AAAATGAGAGTTTGATCCTGGCTCA-3′； 下 游 引 物：5′-CCTTGTTACGACTTCACCCCAATC-3′，引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，預(yù)計(jì)擴(kuò)增目的片段的長度為1.5kb左右。

1.2.5 支原體16SrRNA基因的擴(kuò)增 擴(kuò)增體系：根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)采用25μL反應(yīng)體系，其中包含10×PCR buffer 2.5μL，Mg2＋1.5μL（25mmol／L），dNTP 0.6μL（10mmol／L），TaqDNA 聚合酶0.3 μL（5U／μL），DNA模板2μL，重蒸水15.2μL，上游和下游引物各1μL（25μmol／L）。

PCR擴(kuò)增參數(shù)：94℃5min；94℃1min，50℃1min，72℃90s，30個(gè)循環(huán)；72℃ 10min。預(yù)期PCR產(chǎn)物大小為1.5kb。擴(kuò)增產(chǎn)物用10g／L瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，將目的條帶用DNA回收試劑盒回收。

1.2.6 支原體16SrRNA基因的測序 將PCR產(chǎn)物克隆到質(zhì)粒pMD18-T中，委托寶生物工程（大連）有限公司進(jìn)行基因序列測定。最后將以上測得的序列與GenBank中的標(biāo)準(zhǔn)序列進(jìn)行比較，挑出經(jīng)BLAST軟件比對同源性最高的序列，確定其類型。

1.2.7 藥敏試驗(yàn) 利用藥敏紙片法對所分離的病原體進(jìn)行藥敏感試驗(yàn)，所用藥敏試紙的種類為β-內(nèi)酰胺類：氨芐青霉素、頭孢西丁、苯唑西林；氨基糖苷類：阿米卡星；大環(huán)內(nèi)酯類：紅霉素、克林霉素；四環(huán)素類：多西環(huán)素、四環(huán)素；喹諾酮類：氧氟沙星、諾氟沙星、環(huán)丙沙星；以及氯霉素。支原體藥敏試驗(yàn)的培養(yǎng)條件同支原體分離培養(yǎng)，根據(jù)抑菌圈直徑大小判斷藥物敏感性，判斷標(biāo)準(zhǔn)參照產(chǎn)品說明。

2 結(jié)果

2.1 流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果

自2011年2月開始，該奶牛場部分泌乳牛突然出現(xiàn)精神沉郁，食欲不振（后廢絕），體溫39.5℃～40.5℃，場內(nèi)技術(shù)人員采用青霉素鉀、頭孢西丁、四環(huán)素類抗生素和中藥柴胡等進(jìn)行治療，基本無效，1周后該牛被淘汰。自2月以來，個(gè)別牛只開始表現(xiàn)鼻鏡干燥，陸續(xù)出現(xiàn)體溫升高到39.5℃～41℃，采食量下降，呼吸急促，劇烈干咳，特別在采食后和清晨尤為明顯，瘤胃蠕動音基本消失，胸部聽診有哨樣啰音，有的牛只出現(xiàn)鐵銹色鼻液，黏性膿性鼻液，眼部有分泌物，繼續(xù)使用止咳類和β-內(nèi)酰胺類、氨基糖苷類抗生素藥物治療，效果不佳。到5月奶牛發(fā)病頭數(shù)逐漸增多，泌乳牛群中個(gè)別圈舍奶牛陸續(xù)出現(xiàn)上述呼吸道癥狀，有的甚至出現(xiàn)急性病癥，突然瘋跑，栽倒死亡，乳房炎牛只數(shù)量急劇增加，抗生素治療效果不佳，治愈率低，且反復(fù)發(fā)生率高，頭胎牛發(fā)生流產(chǎn)、死胎；新生犢牛在飼喂乳房炎奶牛的乳汁后，逐漸出現(xiàn)關(guān)節(jié)和蹄部腫大，行走困難，甚至無法站立，精神狀態(tài)極差，并伴有腹瀉等癥狀。自2月至6月以來總計(jì)因上述病癥死亡牛只10頭，犢牛發(fā)病16頭，牛群整體狀況不良。針對上述情況，對發(fā)生肺炎癥狀、發(fā)燒、關(guān)節(jié)炎、以及嚴(yán)重乳房炎，習(xí)慣性流產(chǎn)的成年奶牛和犢牛均建立“癥候圈”單獨(dú)隔離，治療觀察。

剖檢病死奶?？梢娖は鲁誓z凍樣，病理變化主要在胸腔內(nèi)，肺腫大，大部分肉樣變，縱切可見大理石樣花紋（圖2），肺部和胸膜有粘連，胸腔內(nèi)有少量積液。剖開心包，可見心內(nèi)膜腐爛，呈肉芽樣（圖3），有積液，液體為黃色澄清樣。腹腔內(nèi)有大量橙黃色腹水，肝臟腫大呈灰白色，膽囊腫大，脾臟邊緣鈍圓。子宮內(nèi)積有大量灰白色惡臭濃汁，子葉脫落。下頜淋巴結(jié)、肺門淋巴結(jié)、髂下淋巴結(jié)腫大。切開關(guān)節(jié)腔有黃色半透明膿血樣的渾濁液體。

圖2 患牛支原體肺炎的奶牛肺部病理變化Fig.2 The gross pathological lesions in lungs of dairy cow infected with Mycoplasma bovis

圖3 患牛支原體病奶牛的心臟病變Fig.3 The pathological lesions in heart of dairy cow infected with Mycoplasma bovis

2.2 病原體的分離培養(yǎng)

接種于改良的Hayflick支原體液體培養(yǎng)基病料，在傳至第3代后培養(yǎng)基的顏色由渾濁橙黃色逐漸變?yōu)槌吻?、透明的淡黃色；接種普通營養(yǎng)瓊脂血液培養(yǎng)基上的病料經(jīng)37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的二氧化碳環(huán)境下恒溫培養(yǎng)24h后觀察其表面無菌落生長；接種于支原體固體培養(yǎng)基經(jīng)約72h培養(yǎng)后，表面出現(xiàn)突出于支原體培養(yǎng)基表面，呈油煎蛋樣菌落（圖4），挑取較小的單個(gè)菌落接種于支原體液體培養(yǎng)基，經(jīng)37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的二氧化碳環(huán)境下恒溫培養(yǎng)72h，培養(yǎng)基顏色變黃且澄清、透明。挑取“煎蛋樣”菌落抹片，姬姆薩染色后觀察到支原體形態(tài)呈現(xiàn)多形性，有的形似戒指，多數(shù)呈“豆芽樣”（圖5）。

圖4 病料在支原體瓊脂培養(yǎng)基上的生長菌落Fig.4 The colonies of pathogens on Mycoplasmaagar medium

圖5 姬姆薩染色后的支原體形態(tài)Fig.5 The form of Mycoplasmaafter Giemsa staining

2.3 血清學(xué)檢測結(jié)果

經(jīng)酶標(biāo)儀讀數(shù)根據(jù)說明書公式Val=delta OD sample×100／delta OD positive，所得數(shù)值均大于11.40，依照說明書，大于11.40者即為陽性（＋），對檢測的10份牛血清進(jìn)行判定，其中“＋”3頭、“＋＋”6頭、“＋＋＋”1頭。

2.4 16SrRNA基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果

16SrRNA基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1g／L的瓊脂糖凝膠電泳，獲得1.5kb的目的條帶，空白對照未見任何條帶出現(xiàn)，與預(yù)期的擴(kuò)增長度相符（圖6）。

2.5 支原體16SrRNA基因的序列

對16SrRNA擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序分析，上網(wǎng)利用BLAST軟件進(jìn)行序列同源性比較，結(jié)果表明所分離支原體為牛支原體（Mycoplasmabovis），與GenBank中牛支原體16SrRNA序列CP002513.1（MycoplasmabovisHubei-1，complete genome）的同源性為99%，與無乳支原體CU179680.1（MycoplasmaagalactiaePG2chromosome，complete sequence）同源性為99%。

圖6 牛支原體PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.6 PCR amplification results of 16SrRNA of Mycoplasma bovis

2.6 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

整體說來，該支原體耐藥性較為嚴(yán)重，和多數(shù)報(bào)道四環(huán)素類藥物療效較好不一致。因此不同牛場分離的牛支原體藥敏特性有較大差異，本試驗(yàn)中阿米卡星和環(huán)丙沙星應(yīng)為首選藥物（表1）。

表1 牛支原體藥敏試驗(yàn)Table 1 Drug sensitivity test of Mycoplasma bovis

3 討論

經(jīng)過近3個(gè)月對該病原體的系統(tǒng)研究，確定該地區(qū)本次流行的病原為牛支原體和無乳支原體。該病在寧夏地區(qū)奶牛為首次流行。據(jù)文獻(xiàn)記載，1961年牛支原體被鑒定為致牛乳房炎的病原［2］；1976年被描述為導(dǎo)致牛呼吸道疾病的病原［10］。此后，不同國家都有該病的流行［11］。目前，牛支原體已被認(rèn)為是肉牛、奶牛和犢牛發(fā)生呼吸道疾病與多發(fā)性關(guān)節(jié)炎的重要病因。牛支原體既可以導(dǎo)致牛的急性傳染性呼吸系統(tǒng)疾病，還可導(dǎo)致持續(xù)感染和慢性支氣管肺炎以肺干酪樣或凝固性病理特征的壞死病變［5］。牛支原體經(jīng)常和細(xì)菌、病毒協(xié)同，環(huán)境因素如天氣、通風(fēng)不良、過度擁擠、運(yùn)輸?shù)葘⒓觿〔∏?，加之不良的用藥?xí)慣使一些耐藥性細(xì)菌的存在，因此臨床上對多種抗生素的治療效果很差，甚至無效［11］。本次牛支原體病流行的背景支持以上觀點(diǎn)。本次流行中，發(fā)病奶牛均為犢牛與青年牛，經(jīng)調(diào)查此次牛支原體肺炎是由于隔壁某牛場盲目引進(jìn)奶牛，未經(jīng)嚴(yán)格檢驗(yàn)檢疫，加之長途運(yùn)輸時(shí)氣候變化明顯等多種促發(fā)因素，使病情復(fù)雜化。據(jù)文獻(xiàn)記載，患病牛只可通過鼻腔分泌物排出牛支原體，健康牛只可通過近距離接觸病牛而獲得病原，感染發(fā)病。一旦感染，可持續(xù)攜帶病原而成為其他健康牛只的傳染源。牛支原體在自然環(huán)境中存活能力差，但在無光照情況下可存活數(shù)天，例如在4℃的海綿中或牛奶中可存活2個(gè)月之久，20℃存活1周到2周，37℃存活1周，糞中可存活37d［5］。傳統(tǒng)的消毒劑均可達(dá)到消滅該病原的目的。牛支原體雖然可引起肉牛、奶牛與羊的感染，但目前尚無可感染人的報(bào)道。犢牛發(fā)生支原體關(guān)節(jié)炎的主要原因是犢牛飲用了乳房炎患病奶牛的乳汁。發(fā)生牛支原體感染奶牛的牛乳中同樣存在著牛支原體病原，本次試驗(yàn)中從病牛乳汁中分離出病原體；該場將患病奶牛的乳汁飼喂?fàn)倥?，造成新生犢牛的整體暴發(fā)牛支原體性關(guān)節(jié)炎，就充分證明這一點(diǎn)。

本試驗(yàn)從病牛肺部組織、乳汁中分離獲得的病原，采用支原體通用引物進(jìn)行PCR 16SrRNA擴(kuò)增與鑒定，Takahiro Matsuki等學(xué)者認(rèn)為當(dāng)病原的16S rRNA基因可變區(qū)序列同源性大于97%時(shí)，便可認(rèn)為這些病原是屬同一種［12-13］，細(xì)菌分類學(xué)家普遍認(rèn)為，如果兩個(gè)16SrRNA序列同源性低于97%，可以認(rèn)為是屬內(nèi)不同類型的種。由此為依據(jù)，本試驗(yàn)利用分子生物學(xué)方法對誘發(fā)奶牛纖維素性肺炎、久治不愈的乳房炎、關(guān)節(jié)炎的支原體16SrRNA擴(kuò)增，測序，與GenBank中的標(biāo)準(zhǔn)序列進(jìn)行比較，挑出經(jīng)Blast軟件比對同源性高達(dá)99%的序列，得到了牛支原體和無乳支原體，確定了病原類型。

藥敏試驗(yàn)效果不佳，經(jīng)分析主要與該牛場用藥習(xí)慣和牛群對抗生素的耐藥性有關(guān)。結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)，不同牛場分離的牛支原體藥敏特性有較大差異，所以藥敏試驗(yàn)的結(jié)果不一致。針對本次牛支原體的流行建議選用阿米卡星、環(huán)丙沙星，在防治中起到了一定的效果。另據(jù)報(bào)道早期使用泰樂菌素類（泰樂菌素、替米考星、瑞可新）及泰妙菌素類抗菌藥（支原凈、沃尼妙林）也有一定效果［11］。

［1］ Pfutzner H，Sachse K.Mycoplasma bovis as an agent of mastitis，pneumonia，arthritis and genital disorders.Scientific and Technical Review［J］.Offices International Des Epizooties，1996，15（4）：1477-1494.

［2］ Hale H H，Helmboldt C F，Plastridge W N，et al.Bovine mastitis caused by Mycoplasmaspecies［J］.Cornell Vet，1962，52：582-591.

［3］ Nicholas R A J，Baker S，Ayling R D，et al.Mycoplasma infections in growing cattle［J］.Cattle Practice，2000，8：115-118.

［4］ 黎濟(jì)申.牛的霉形體性乳房炎［J］.上海畜牧獸醫(yī)通訊，1983（4）：46.

［5］ 石 磊，龔 瑞，尹爭艷，等.肉牛傳染性牛支原體肺炎流行的初步診斷［J］.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，27（4）：572.

［6］ 李新民，何生虎，曹 志，等.牛傳染性支原體肺炎病的初步診斷［J］.黑龍江畜牧獸醫(yī).2011（5）：107。

［7］ Hayflick L.Tissue cultures and mycoplasmas［J］.Tex Rep Bio Med，1965，23：（Suppl.1），285.

［8］ Hoelzle L E，Adeh D，Hoelzle K，et al.Development of a diagnostic PCR assay based on novel DNA sequences for the detection of Mycopasma suis （Eperythrozoon suis）in porcine blood［J］.Vet Microbiol，2003，93（3）：l85-196.

［9］ Dutro S M，Hebb J K，Garin C A，et al.Development and performance of a microwell plate based polymerase chain reactionassay for Mycoplasma genitalium［J］.Sex Transm Dis，2003，30（10）：756-763.

［10］ Gourlay R N，Thomas L H，Howard C J.Pneumonia and arthritis in gnotobiotic calves following inoculation with Mycoplasma agalactiae subsp.bovis［J］.Vet Rec，1976，98：506-507.

［11］ Caswell J L，Archambault M.Mycoplasma bovis pneumonia in cattle［J］.Anim Health Res Rev，2007，8（2）：161-186.

［12］ Braddock J A，Tasker S，Malik R.The use of rea1time PCR in the diagnosis and monitoring of Mycoplasrna haemofelis copy number in anaturally infected eat［J］.J Feline Med Surg，2004，6（3）：161-165.

［13］ Biddle M K，F(xiàn)ox L K，Evans M A，et al.Pulsed-field gel electrophoresis patterns of Mycoplasmaisolates from various body sites in dairy cattle with Mycoplasma mastitis［J］.J Am Vet Med Assoc，2005，227：445-459.