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    豬附紅細(xì)胞體感染途徑研究

    2012-08-14 08:01:26賈立軍鞠玉琳
    關(guān)鍵詞:體病皮下感染率

    司 唯,姚 琳,賈立軍,鞠玉琳

    (延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院動(dòng)物醫(yī)學(xué)系,吉林延吉133002)

    附紅細(xì)胞體?。ê?jiǎn)稱附紅體病)是由附紅細(xì)胞體(Eperythrozoon)寄生于紅細(xì)胞表面或游離于紅細(xì)胞內(nèi)、血漿、組織液及腦脊液中引起的以發(fā)熱、溶血性貧血和黃疸為主要特征的人獸共患?。?-2]。豬附紅細(xì)胞體病嚴(yán)重影響著養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展,逐漸被人們所重視。由于各個(gè)年齡段、各種品種的豬均能感染豬附紅細(xì)胞體病,且仔豬發(fā)病率高,死亡率也高,如不能及時(shí)有效地控制該病的傳播,無(wú)疑會(huì)給養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)十分慘重的代價(jià)[3]。所以,明確豬附紅細(xì)胞體病的傳播途徑就成為了防治該病工作中的重中之重。針對(duì)這一現(xiàn)狀,我們?cè)噲D采用接觸感染(皮膚涂抹)、口服感染、傷口感染、皮下注射感染和呼吸道感染等5種途徑進(jìn)行試驗(yàn),以確定豬附紅細(xì)胞體病的傳播途徑,為豬附紅細(xì)胞體的防治提供可靠資料。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及病原體 昆明小鼠70只,20g~22g,由延邊大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。紅細(xì)胞的豬附紅細(xì)胞體感染率達(dá)95%以上的血液樣本,按照姚琳[4]方法制備紅細(xì)胞泥。

    1.1.2 試劑與儀器 地塞米松(5mg/mL)為鄭州卓峰制藥有限公司產(chǎn)品;姬姆薩染色原液。低速離心機(jī)(DL-5-B),立式滅菌器(ES-315),電子天平(FA/JA1104),顯微鏡(OLYMPUS),通風(fēng)櫥。

    1.2 方法

    1.2.1 病原體的檢測(cè) 按照參考文獻(xiàn)[5-7]的方法對(duì)病原體分別進(jìn)行血液壓滴標(biāo)本檢測(cè)、姬姆薩染色檢測(cè)和PCR檢測(cè)。

    1.2.2 小鼠感染豬附紅細(xì)胞體試驗(yàn) 將35只小鼠隨機(jī)分為7個(gè)組,每組5只,進(jìn)行感染豬附紅細(xì)胞體試驗(yàn)。7個(gè)小組分別為皮下組、皮膚組、口服組、傷口組、呼吸道組、呼吸道空白組以及空白組。小鼠腹腔注射地塞米松(0.2mL/只),2d1次,共3次。皮下組、皮膚組和口服組:分別采用皮下、皮膚、灌胃途徑接種0.5mL/只的紅細(xì)胞泥。傷口組:采用體側(cè)薄皮部劃痕接種方法接種0.5mL/只的紅細(xì)胞泥,劃痕長(zhǎng)度為1cm~2cm。空白組:皮下注射0.5 mL/只生理鹽水。呼吸道組:5只小鼠和紅細(xì)胞泥一并放置于密閉的通風(fēng)櫥內(nèi)一側(cè),其中將紅細(xì)胞泥放置于冰盒上的平皿中7d,每6h更換一次冰袋。呼吸道空白組:條件同上,但不放置紅細(xì)胞泥。在上述條件下用相同的方法另選35只小鼠做相同的試驗(yàn),但感染小鼠的紅細(xì)胞泥劑量為0.2mL/只。連續(xù)30d由小鼠尾部采血制成鮮血壓滴標(biāo)本,在400倍鏡下觀察并記錄、統(tǒng)計(jì)豬附紅細(xì)胞體在小鼠體內(nèi)的消長(zhǎng)情況曲線。

    1.2.3 紅細(xì)胞感染情況觀察及計(jì)數(shù)方法 顯微鏡下選擇5個(gè)視野分別觀察豬附紅細(xì)胞體的感染情況,觀察紅細(xì)胞形態(tài)及紅細(xì)胞表面豬附紅細(xì)胞體的形態(tài)、大小、折光性并以百分率來(lái)表示感染率。

    2 結(jié)果

    2.1 病原體檢測(cè)結(jié)果

    2.1.1 血液壓滴標(biāo)本檢查 經(jīng)對(duì)感染豬附紅細(xì)胞體的豬血進(jìn)行血液壓滴標(biāo)本檢查,感染豬附紅細(xì)胞體的紅細(xì)胞邊緣不整,呈星芒狀、鋸齒狀、菠蘿樣形狀,紅細(xì)胞內(nèi)和血漿中可見(jiàn)豬附紅細(xì)胞體,大多呈球形、逗號(hào)形、條形細(xì)小顆粒狀,豬附紅細(xì)胞體在鏡下有折光性,并且紅細(xì)胞表面有黑色疤痕,紅細(xì)胞感染率達(dá)到95%以上。

    2.1.2 姬姆薩染色標(biāo)本檢查 經(jīng)對(duì)感染豬附紅細(xì)胞體的豬血進(jìn)行姬姆薩染色標(biāo)本檢查,在1 000倍光學(xué)顯微鏡下觀察到紅細(xì)胞一般呈紫紅色,豬附紅細(xì)胞體則是在紅細(xì)胞體上可見(jiàn)藍(lán)紫色的具有折光性的疤痕。

    2.1.3 PCR擴(kuò)增 以膜蛋白OxaA為引物,對(duì)血液樣本進(jìn)行PCR檢測(cè),部分臨床樣本PCR檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖1可知,血液樣本2、5、6、9分別在386bp處擴(kuò)增出較亮的電泳條帶,其他樣本均未擴(kuò)增出任何條帶,說(shuō)明樣本2、5、6、9可以作為病原體血液樣本。

    選取經(jīng)3種方法共同檢測(cè)出的病原體為本試驗(yàn)的陽(yáng)性血液。

    圖1 血液樣本的PCR鑒定Fig.1 PCR analysis of the blood samples

    2.2 小鼠感染豬附紅細(xì)胞體試驗(yàn)結(jié)果

    2.2.1 小鼠感染紅細(xì)胞泥劑量0.5mL/只的結(jié)果

    小鼠在注射地塞米松后,除空白組,各試驗(yàn)組小鼠均在感染豬附紅細(xì)胞體后,在第3天出現(xiàn)食欲減退,精神沉郁,弓背聳毛的現(xiàn)象,第21天以后小鼠的精神狀態(tài)、食欲趨于正常。空白組小鼠精神狀態(tài)和食欲等均正常。30d內(nèi)的小鼠感染豬附紅細(xì)胞體的觀察結(jié)果如圖2所示。

    由圖2可知,5個(gè)感染試驗(yàn)組分別在不同程度上感染了豬附紅細(xì)胞體,其中傷口組和口服組在第3天開(kāi)始感染豬附紅細(xì)胞體,第6天時(shí)皮膚組、皮下組和呼吸道組都呈上升趨勢(shì)。在感染過(guò)程中發(fā)現(xiàn)傷口組和皮下組在第9天達(dá)到感染高峰并且傷口組的感染率最高,達(dá)到了96%。皮下組的感染高峰為20%;口服組、呼吸道組和皮膚組在第12天均出現(xiàn)感染高峰,感染率分別達(dá)到了89%、80%和19%。傷口組在第12天到第15天感染率急劇下降,直至第27天感染率為0;口服組和呼吸道組從第12天開(kāi)始均呈現(xiàn)下降的趨勢(shì),分別從第27天和第21天感染率降為0。

    圖2 小鼠感染豬附紅細(xì)胞體(0.5mL/只)情況Fig.2 The infection situation of E.suis(0.5mL)in mice

    2.2.2 小鼠感染紅細(xì)胞泥劑量0.2mL/只的結(jié)果

    小鼠在免疫抑制后,除空白組之外,各試驗(yàn)組小鼠均在感染豬附紅細(xì)胞體后第5天出現(xiàn)食欲減退,精神沉郁,弓背聳毛的現(xiàn)象,第20天以后小鼠的精神狀態(tài)、食欲趨于正常。空白組小鼠精神狀態(tài)和食欲等均正常。30d內(nèi)的小鼠感染豬附紅細(xì)胞體的觀察見(jiàn)圖3。

    圖3 小鼠感染豬附紅細(xì)胞體(0.2mL/只)情況Fig.3 The infection situation of E.suis(0.2mL)in mice

    由圖3可知,5個(gè)感染試驗(yàn)組分別在不同程度上感染了豬附紅細(xì)胞體,其中傷口組和口服組在第3天開(kāi)始感染豬附紅細(xì)胞體,第6天時(shí)皮膚組和呼吸道組出現(xiàn)感染情況,皮下組在第9天的時(shí)候出現(xiàn)感染情況。在感染過(guò)程中發(fā)現(xiàn)傷口組第12天達(dá)到感染高峰并且該組的感染率最高,達(dá)到了75%;口服組和呼吸道組在第18天和第15天出現(xiàn)感染高峰,感染率分別達(dá)到了35%和39%;皮下組在第18天達(dá)到高峰,感染率為41%。傷口組、皮膚組和呼吸道組在第15天開(kāi)始感染率急劇下降,分別在第24天、第18天和第21天降為0;口服組從第18天開(kāi)始均呈現(xiàn)均勻下降的趨勢(shì),第27天感染率降為0。

    3 討論

    綜合本試驗(yàn)結(jié)果,傷口組的小鼠從第3天開(kāi)始感染豬附紅細(xì)胞體,第9天出現(xiàn)感染高峰,感染率達(dá)到96%,此現(xiàn)象出現(xiàn)的原因可能是由于傷口處于表皮層,豬附紅細(xì)胞體通過(guò)皮下組織與真皮交界處的深部血管網(wǎng)直接進(jìn)入動(dòng)脈??诜M小鼠通過(guò)灌胃途徑在第12天感染率達(dá)89%,此結(jié)果的產(chǎn)生可能是豬附紅細(xì)胞體進(jìn)入消化系統(tǒng)后通過(guò)消化道黏膜、黏膜下膜、肌膜和漿膜進(jìn)入毛細(xì)血管,最終進(jìn)入全身血液循環(huán),該組感染模型的維持時(shí)間最長(zhǎng)的原因也許是該組小鼠感染的豬附紅細(xì)胞體在體內(nèi)滯留時(shí)間較長(zhǎng)所導(dǎo)致的。呼吸道組小鼠感染率在第12天達(dá)到高峰,感染率為80%,這一結(jié)果也許是因?yàn)樨i附紅細(xì)胞體通過(guò)小鼠呼吸系統(tǒng)進(jìn)入肺部的毛細(xì)血管進(jìn)而進(jìn)入肺動(dòng)脈,最后進(jìn)入全身血液循環(huán)。皮膚組小鼠感染率較低,僅為19%,并且維持時(shí)間較短,出現(xiàn)這一結(jié)果可能是由于豬附紅細(xì)胞體通過(guò)表皮滲透而進(jìn)入小鼠體內(nèi),但是由于表皮無(wú)血管所以只有微量的豬附紅細(xì)胞體進(jìn)入小鼠體內(nèi)。但皮下組是經(jīng)過(guò)皮下注射而感染的,其感染率與皮膚組相近,感染率為20%,與皮膚組僅差1%,所以皮膚組的感染途徑不容忽視。

    豬附紅細(xì)胞體病屬于一種季節(jié)性疾?。?],多發(fā)性季節(jié)為9、10月份。在不同的季節(jié)致病性強(qiáng)弱也不同[9]。本試驗(yàn)中的各試驗(yàn)組所用的血液樣本采自3月份和6月份,并不是在該病多發(fā)的季節(jié)采取,至于在多發(fā)性季節(jié)采取的血液樣本會(huì)不會(huì)出現(xiàn)與該試驗(yàn)相同的結(jié)果還需要進(jìn)一步的探討。小鼠在感染第18天以后均出現(xiàn)體內(nèi)的豬附紅細(xì)胞體逐漸減少直至第27天完全消失的情況,其原因之一為免疫抑制劑隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而失效;其二,隨著時(shí)間的延長(zhǎng)小鼠的免疫力得到恢復(fù)所導(dǎo)致。

    通過(guò)觀察兩次不同劑量的試驗(yàn)所得到的結(jié)果,我們可以看出感染0.2mL/只豬附紅細(xì)胞體的小鼠的感染率明顯低于感染0.5mL/只豬附紅細(xì)胞體的小鼠的感染率,并且出現(xiàn)感染的時(shí)間較后者晚2d,其消亡的時(shí)間則早于后者1d。這可能是由于兩次試驗(yàn)給予小鼠的豬附紅細(xì)胞體的劑量差異所導(dǎo)致,說(shuō)明豬附紅細(xì)胞體劑量不同感染率也不同。

    本試驗(yàn)結(jié)果證明,當(dāng)小鼠免疫力低下時(shí),易感豬附紅細(xì)胞體,并且通過(guò)皮下、皮膚、口服、傷口、呼吸道5種途徑都可感染,這說(shuō)明豬附紅細(xì)胞體在一定條件下會(huì)危害人類的健康和畜牧業(yè)的發(fā)展。因此獸醫(yī)工作者、屠宰場(chǎng)工作人員、飼養(yǎng)員等應(yīng)加強(qiáng)自身防護(hù)。本試驗(yàn)為該病的防治提供了科學(xué)依據(jù)。

    [1] Neimark,H,Hoff B,Ganter M.Mycoplasma ovis nov.(formerly Eperythrozoon ovis),an epierythrocytic agent of haemolytic anaemia in sheep and goats[J].Int J System Evolut Microbiol,2004,54:365-371.

    [2] 呂成林,蘇秀華,崔月榮,等.附紅細(xì)胞體病的病原學(xué)及診斷方法研究進(jìn)展[J].山東畜牧獸醫(yī),2011(8):84-86.

    [3] 夏道倫.豬附紅細(xì)胞體病的危害及其防治[J].飼料與畜牧,2011(7):14-15.

    [4] 姚 琳,張守發(fā),賈立軍,等.豬附紅細(xì)胞體有效消毒藥的體外初步篩選試驗(yàn)[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2011,32(9):125-128.

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    [6] 薛書江,賈立軍,田萬(wàn)年,等.豬附紅細(xì)胞體幾種染色方法的比較[J].畜牧與獸醫(yī),2005,37(11):35-37.

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    [8] 李清艷,翟向和,李新民,等.附紅細(xì)胞體病紅細(xì)胞免疫功能的研究[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2004,25(3):100-101.

    [9] 馮會(huì)權(quán),徐 昆,宋立先,等.豬附紅細(xì)胞體感染BALB/c小鼠模型的建議及相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)[J].畜牧與獸醫(yī),2011,43(1):63-65.

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