山羊美麗筒線蟲(chóng)ITS序列的PCR擴(kuò)增及分析

王亞男，宋軍科，趙光輝，邊青青，于三科

（西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，陜西楊凌712100）

寄生于宿主食道黏膜下的美麗筒線蟲(chóng)（Gongylonema pulchrum）是一種細(xì)線狀、乳白色的線蟲(chóng)，屬于旋尾目筒線科，呈世界性分布［1］。其宿主范圍十分廣泛，以包括靈長(zhǎng)類(lèi)在內(nèi)的多種哺乳動(dòng)物為終末宿主，如牛、綿羊、山羊、駱駝、豬、馬、鹿、熊、嚙齒類(lèi)動(dòng)物等［2-5］，以金龜子和蟑螂為其中間宿主［6］，偶爾可在人體寄生，人體寄生的最早病例是由Leidy［7］在美國(guó)費(fèi)城發(fā)現(xiàn)的。此后世界各地陸續(xù)有散在的病例報(bào)道。中國(guó)自1955年在河南發(fā)現(xiàn)第1例病人后，迄今已報(bào)道百余例，分布于山東、黑龍江、遼寧、內(nèi)蒙古、甘肅、陜西、青海、四川、北京、河北、天津、河南、山西、上海、江蘇、湖北、湖南、福建、廣西等19個(gè)省（市、區(qū)），其中山東報(bào)告的病例最多［8-13］。人感染美麗筒線蟲(chóng)后常表現(xiàn)精神癥狀如妄想癥等［14］，動(dòng)物感染造成動(dòng)物漸進(jìn)性消瘦，影響其生產(chǎn)性能。

美麗筒線蟲(chóng)形態(tài)學(xué)鑒定較為困難，常因需要專(zhuān)家等不能普及應(yīng)用，需要一種更為準(zhǔn)確、方便、普及的檢查方法。核糖體內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（internal transcribed spacer，ITS）序列有著顯著的株間差異，可揭示種間甚至種內(nèi)多態(tài)性，已被廣泛用于寄生蟲(chóng)分子學(xué)鑒定和變異分析。

本研究對(duì)采自陜西神木的美麗筒線蟲(chóng)進(jìn)行ITS的PCR擴(kuò)增、克隆、測(cè)序及序列分析，以期為美麗筒線蟲(chóng)的分子鑒定提供基礎(chǔ)資料［15-17］。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 蟲(chóng)體 采自陜西省榆林市神木縣山羊食道分離出的食道寄生蟲(chóng)，經(jīng)過(guò)初步形態(tài)學(xué)鑒定為美麗筒線蟲(chóng)［6］，樣品代碼為 G.P，在750mL／L酒精中保存，用于提取DNA。

1.1.2 試劑盒與載體 DNA提取試劑盒（康為世紀(jì)）、DNA膠回收試劑盒（康為世紀(jì)）、pMD19-T載體（TaKaRa公司）。

1.1.3 引物 上游引物NC5：5′-GTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATT-3′；下游引物 NC2：5′-TTAGTTTCTTTTCCTCCGCT-3′；由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 蟲(chóng)體DNA的提取 從-20℃酒精保存液中取出單個(gè)蟲(chóng)體，置于新鮮滅菌過(guò)的平皿中，用蒸餾水清洗5次，剪碎，置于1.5mL離心管中，加入180μL buffer GTL，用研磨棒充分研磨30min，然后加入20μL蛋白酶K，漩渦震蕩使其徹底混勻，置于56℃水浴鍋中過(guò)夜消化，次日按照康為世紀(jì)DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.2.2 PCR擴(kuò)增 PCR反應(yīng)體系為25μL，包括雙蒸水17μL，10×buffer 2.5μL，Mg2＋3μL，DNTP 2μL，上游引物（NC5）／下游引物（NC2）各0.25μL，rTaqDNA聚合酶0.25μL，模板DNA各2μL，加入各物質(zhì)后，混勻，于手掌離心機(jī)上瞬時(shí)離心，設(shè)空白對(duì)照，置PCR儀上擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃5min；94℃2min，45℃45s，72℃2min，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物在含溴化乙錠（EB）的10g／L瓊脂糖凝膠上電泳，紫外光下觀察擴(kuò)增結(jié)果。

1.2.3 目的DNA片段的回收與連接 將電泳驗(yàn)證的已擴(kuò)增成功的PCR產(chǎn)物全部點(diǎn)樣于含溴化乙錠（EB）的10g／L瓊脂糖凝膠上再次電泳，切下含有目的條帶的瓊脂快，用DNA膠回收試劑盒進(jìn)行回收，取4μL膠回收產(chǎn)物與1μL pMD19-T Vector和5μL SolutionⅠ在16℃下過(guò)夜連接。

1.2.4 轉(zhuǎn)化與克隆 分裝感受態(tài)細(xì)胞，每管25 μL，取10μL連接物與感受態(tài)細(xì)胞混勻，置于冰水混合物上30min后，置于42℃水浴鍋中2min，輕輕取出，冰上放置3min。每一管加入800μL培養(yǎng)基，放入搖床2h，之后取出6 000r／min離心5min。將管中上層液體去除，留100μL左右搖勻，均勻涂抹于氨芐平板上，過(guò)夜培養(yǎng)。然后挑取單個(gè)菌落5個(gè)分別接種于1mL含Amp＋1.5μL的LB液體培養(yǎng)基中，于37℃以220r／min搖振培養(yǎng)7h。

1.2.5 測(cè)序與分析 挑選G.P樣品中鑒定為陽(yáng)性的克隆送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)公司測(cè)序，然后將測(cè)序結(jié)果用DNA Star軟件進(jìn)行序列分析和比較。

2 結(jié)果

2.1 PCR擴(kuò)增結(jié)果

將PCR產(chǎn)物于10g／L瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)，獲得了長(zhǎng)度均為900bp的片段，與預(yù)期的擴(kuò)增片段長(zhǎng)度相符，且特異性和重復(fù)性好（圖1）。

2.2 克隆、轉(zhuǎn)化及菌液PCR

用DNA膠回收試劑盒回樣品G.P3的PCR產(chǎn)物并將之克隆到pMD19-T載體，然后轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞并進(jìn)行菌液PCR鑒定，代碼為G.PC1、G.PC2、G.PC3、G.PC4、G.PC5。將菌液PCR擴(kuò)增產(chǎn)物于10g／L瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，可見(jiàn)大小約為900bp，與預(yù)期目的片段大小一致的條帶（圖2）。

圖1 美麗筒線蟲(chóng)ITS序列的PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 PCR amplification of ITS rDNA of G.P

圖2 美麗筒線蟲(chóng)ITS序列菌液PCR鑒定Fig.2 PCR Identification of G.P ITS sequence bacterium fluid

2.3 序列鑒定與分析

2.3.1 序列鑒定 將篩選出的3個(gè)陽(yáng)性克隆送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序，獲得了核苷酸序列。經(jīng)GenBankTM中G.pulchrum標(biāo)準(zhǔn)序列比較鑒定，確認(rèn)為ITS序列。長(zhǎng)度為1 035bp，3個(gè)序列完全一致。

2.3.2 序列分析 將此序列分別與GenBankTM中收錄的美麗筒線蟲(chóng)日本鹿分離株（B513721.1）代碼為d.j、伊朗肉牛分離株（AB495392.1）代碼為c.i及日本牛和野生動(dòng)物分離株（AB646060.1）代碼為c.j的參考序列進(jìn)行比對(duì)（圖3），結(jié)果表明，美麗筒線蟲(chóng)分離株與3個(gè)參考株的相似性介于98.1%～99.7%之間，與伊朗肉牛和日本鹿分離株相似性最高，為99.7%。ITS2、5.8S序列與參考株相似性均達(dá)到100%（圖4～圖6），其中“d.j”為 NCBI中注冊(cè)的G.pulchrumITS序列，注冊(cè)號(hào)AB513721.1；“c.j”為NCBI中注冊(cè)的G.pulchrumITS序列，注冊(cè)號(hào) AB646060.1；“c.i”為 NCBI中注冊(cè)的G.pulchrumITS序列，注冊(cè)號(hào)AB495392.1。

圖3 G.P ITS序列與GenBankTM公布的美麗筒線蟲(chóng)ITS序列比較Fig.3 The comparison of ITS sequences of G.P with those available in GenBankTM

圖4 G.P ITS1序列與GenBankTM公布的美麗筒線蟲(chóng)ITS1序列相似性比較Fig.4 Similarity comparison of ITS1sequences of G.P with those available in GenBankTM

圖5 G.P 5.8S序列與GenBankTM公布的美麗筒線蟲(chóng)5.8S序列相似性比較Fig.5 Similarity comparison of 5.8Ssequences of G.P with those available in GenBankTM

圖6 G.P ITS2序列與GenBankTM公布的美麗筒線蟲(chóng)ITS2序列相似性比較Fig.6 Similarity comparison of ITS2sequences of G.P with those available in GenBankTM

3 討論

rDNA序列因其功能上的高度保守性和進(jìn)化的時(shí)鐘性，已被越來(lái)越多地用于物種分類(lèi)和遺傳進(jìn)化關(guān)系的研究，尤其是種間分類(lèi)研究［18］。ITS序列是rDNA中介于18S和28S之間的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)，包含核糖體第一內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)ITS1和核糖體第二內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)ITS2兩段序列，有時(shí)也將ITS1，5.8S rRNA和ITS2統(tǒng)稱(chēng)為ITS區(qū)。由于ITS序列進(jìn)化速度快，具有種內(nèi)變異小而種間變異大的特性，是種類(lèi)鑒定和系統(tǒng)發(fā)育分析的重要分子標(biāo)記［18-19］。以ITS為遺傳標(biāo)記，進(jìn)行PCR擴(kuò)增與序列比較已成功地應(yīng)用于多種寄生蟲(chóng)的分子鑒定和分類(lèi)［20］。

本研究中選用的分離株是從神木的山羊中分離得到的。對(duì)其ITS序列的擴(kuò)增與序列分析，結(jié)果顯示美麗筒線蟲(chóng)分離株ITS1與參考株的相似性為98.1%～99.7%，ITS2、5.8S序列與參考株相似性達(dá)到100%。美麗筒線蟲(chóng)可感染人，在臨床上沒(méi)有特征性的癥狀和診斷方法，目前對(duì)其的分子學(xué)研究比較少見(jiàn)，尤其是羊分離株。本研究報(bào)道了山羊美麗筒線蟲(chóng)的ITS序列，對(duì)其分離株的基因組序列變化進(jìn)行分析，有助于了解美麗筒線蟲(chóng)的致病特性和變異情況，為美麗筒線蟲(chóng)的分子生物學(xué)的進(jìn)一步研究奠定了基礎(chǔ)。

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