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    抗非洲豬瘟病毒VP73蛋白單克隆抗體的制備

    2012-08-14 08:01:26吳曉東鄒艷麗趙金山包靜月曹金山王志亮
    動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展 2012年12期
    關(guān)鍵詞:雜交瘤腹水豬瘟

    陳 軼,吳曉東,鄒艷麗,趙金山,包靜月,曹金山,王志亮*

    (1.中國動物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心,山東青島266114;2.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院,內(nèi)蒙古呼和浩特010018)

    非洲豬瘟(African swine fever,ASF)是一種由非洲豬瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)感染引起的豬的急性、烈性、高度接觸性傳染?。?]。ASFV是非洲豬瘟病毒科(Asfarviridae)非洲豬瘟病毒屬(Asfivirus)惟一成員[2],為具有囊膜的雙股DNA病毒,蜱類是其主要自然宿主和傳播媒介[3-4]。ASFV感染豬后以高熱、食欲廢絕、皮膚和內(nèi)臟器官出血為臨床特征,病死率極高[5]。因此,ASF是世界動物衛(wèi)生組織(OIE)要求法定報(bào)告的動物疫病,也是《中華人民共和國動物防疫法》規(guī)定的一類動物疫病[6]。

    ASFV整個(gè)基因組含有160個(gè)~175個(gè)開放閱讀框(ORF),編碼150種~200種蛋白質(zhì)[7]。根據(jù)Pubmed中所列西班牙BA71V分離株全基因序列顯示,ASFV基因組含有151個(gè)主要閱讀框,編碼數(shù)量眾多的蛋白[7]。VP73蛋白是ASFV的主要結(jié)構(gòu)蛋白,由B646L基因編碼,全蛋白分子質(zhì)量約為73 ku[8]。VP73蛋白是病毒粒子20面體衣殼的重要組成部分,產(chǎn)生于病毒感染的晚期,約占整個(gè)病毒粒子蛋白的32%[9]。VP73蛋白在ASFV結(jié)合和進(jìn)入易感細(xì)胞過程中有很重要的作用[10],并對病毒粒子衣殼的產(chǎn)生起至關(guān)重要的作用[11]。ASFV大多數(shù)分離株的毒力都很強(qiáng),但是免疫原性很低,只有少數(shù)幾個(gè)蛋白具有免疫原性。有研究表明,不同區(qū)域ASFV分離株誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗VP73蛋白抗體的相應(yīng)抗原表位都相當(dāng)保守[12]。VP73蛋白的免疫原性很穩(wěn)定[13],可以被用來作為血清學(xué)檢測和免疫制劑。李倩等[14]對非洲豬瘟病毒VP73蛋白的B細(xì)胞表位進(jìn)行了預(yù)測。本研究在對ASFV VP73蛋白主要抗原表位區(qū)原核表達(dá)的基礎(chǔ)上,制備了相應(yīng)的單克隆抗體。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 菌種、質(zhì)粒、動物和細(xì)胞 宿主菌E.coli BL21(DE3)為Invitrogen公司產(chǎn)品;重組質(zhì)粒pET32a-vp73、非洲豬瘟病毒陽性血清、Balb/c小鼠及小鼠骨髓瘤細(xì)胞株(SP2/0)均由中國動物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心保存。

    1.1.2 試劑 非預(yù)染蛋白Marker和預(yù)染蛋白Marker為Fermentas公司產(chǎn)品;His Bind Purification Kit為Novagen公司產(chǎn)品;BCA蛋白定量試劑盒為Biomiga公司產(chǎn)品;弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、PEG和辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗鼠和羊抗豬IgG均為Sigma公司產(chǎn)品;HT、HAT和DMEM均為Invitrogen公司產(chǎn)品;胎牛血清為Thermo Fisher Scientific公司產(chǎn)品。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

    1.2 方法

    1.2.1 免疫原的制備

    1.2.1.1 重組質(zhì)粒的鑒定和表達(dá) 用BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切重組質(zhì)粒pET32a-vp73,將酶切產(chǎn)物進(jìn)行30g/L瓊脂糖凝膠電泳。將重組質(zhì)粒pET32a-vp73委托寶生物工程(大連)有限公司測序。將空質(zhì)粒pET32a(+)和重組質(zhì)粒pET32avp73分別轉(zhuǎn)化至E.coli BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中。將重組菌接種至含氨芐青霉素抗性的LB液體培養(yǎng)基中,37℃振搖至OD 600nm值約為0.6,加入終濃度為0.8mmol/L的IPTG,誘導(dǎo)4.5h,菌體裂解后,120mL/L SDS-PAGE電泳鑒定蛋白表達(dá)情況。

    1.2.1.2 目的蛋白的純化及鑒定 按His Bind Purification Kit操作說明純化重組vp73蛋白,BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。以非洲豬瘟陽性血清為一抗,HRP標(biāo)記的羊抗豬IgG為二抗,Western blot鑒定目的蛋白。

    1.2.2 MAb的制備

    1.2.2.1 動物免疫 初免用弗氏完全佐劑乳化純化的重組vp73蛋白,皮下注射免疫8周齡的Balb/c小鼠(100μg/只);二免三免用弗氏不完全佐劑乳化純化后的重組vp73蛋白,皮下注射免疫(100 μg/只);每次免疫間隔14d。于融合前3d以50 μg/只的劑量腹腔注射加強(qiáng)免疫一次。

    1.2.2.2 雜交瘤細(xì)胞株的建立 加強(qiáng)免疫Balb/c小鼠3d后,按常規(guī)方法無菌取小鼠脾細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞在PEG的作用下融合,融合細(xì)胞在含200mL/L胎牛血清的HAT培養(yǎng)基中進(jìn)行選擇性培養(yǎng),5d后半換液,10d后改用HT培養(yǎng)基培養(yǎng)。待細(xì)胞長至培養(yǎng)孔1/5以上時(shí),吸取培養(yǎng)上清以間接ELISA方法篩選陽性孔,采用有限稀釋法對陽性雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行連續(xù)3次克隆化,直至克隆孔陽性率達(dá)到100%,擴(kuò)大培養(yǎng),凍存。

    1.2.2.3 腹水誘生 將陽性雜交瘤細(xì)胞以5×105個(gè)/只~10×105個(gè)/只的劑量腹腔注射經(jīng)液體石蠟致敏后的Balb/c小鼠,7d~10d后收集腹水,可取多次,10 000r/min離心10min取上清,分裝標(biāo)記并凍存。

    1.2.3 MAb特異性鑒定

    1.2.3.1 酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)檢測 將純化后的重組vp73蛋白和含pET-32a(+)空質(zhì)粒的菌體蛋白,用包被液稀釋至2μg/mL,分別包被ELISA板,以制備的單克隆抗體腹水和培養(yǎng)液上清為一抗,HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG為二抗,進(jìn)行間接ELISA。

    1.2.3.2 Western blot檢測 將純化后的重組vp73蛋白和含pET-32a(+)空質(zhì)粒的菌體蛋白進(jìn)行120mL/L SDS-PAGE電泳,轉(zhuǎn)印PVDF膜,以制備的單克隆抗體腹水和培養(yǎng)液上清為一抗,HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG為二抗,DAB顯色。

    1.2.3.3 MAb亞類及效價(jià)測定 按說明書操作應(yīng)用MAb亞類鑒定試劑盒對MAb的亞類進(jìn)行鑒定。單抗腹水作倍比稀釋,采用間接ELISA測定單抗腹水的效價(jià)。

    2 結(jié)果

    2.1 重組質(zhì)粒酶切鑒定與測序結(jié)果

    酶切結(jié)果顯示,重組質(zhì)粒經(jīng)BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切,獲得大小約為612bp的目的DNA片段及5 900bp左右的pET-32a(+)載體片段,初步表明重組質(zhì)粒中含有預(yù)期大小的目的DNA片段(圖1)。測序結(jié)果表明,載體插入目的DNA片段長度為612 bp,與GenBank中的非洲豬瘟病毒VP73基因序列(登陸號S89966,627bp~1 238bp)比對結(jié)果一致,證明目的DNA片段插入正確。

    圖1 重組質(zhì)粒pET32a-vp73酶切分析Fig.1 Identification of recombinant plasmid pET32a-vp73with enzyme digestion

    2.2 目的蛋白SDS-PAGE電泳、純化、濃度測定及Western blot檢測

    120mL/L SDS-PAGE電泳結(jié)果分析表明重組菌在終濃度為0.8mmol/L的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)4.5 h后可產(chǎn)生大小約為43ku的融合蛋白條帶,與預(yù)期結(jié)果基本一致,且目的蛋白純化效果較好(圖2)。純化后目的蛋白濃度為2.5mg/mL。Western blot檢測表明該融合蛋白具有良好的反應(yīng)原性(圖3)。

    2.3 細(xì)胞株的篩選及克隆化

    經(jīng)篩選,得到3株(1C8、2D5、5F6)針對 ASFV VP73蛋白主要抗原表位區(qū)的MAb雜交瘤細(xì)胞株,經(jīng)三次亞克隆后陽性率達(dá)到100%,雜交瘤凍存復(fù)蘇后,其中兩株(2D5、5F6)喪失分泌抗體的能力,最終得到一株穩(wěn)定分泌抗體的雜交瘤細(xì)胞株(1C8)。

    圖2 pET32a-vp73表達(dá)產(chǎn)物及純化產(chǎn)物SDS-PAGE分析Fig.2 SDS-PAGE of pET32a-vp73expression products and purified products

    圖3 VP73蛋白的免疫印跡分析Fig.3 Western blot analysis of VP73protein

    2.4 MAb的鑒定

    2.4.1 ELISA檢測結(jié)果 結(jié)果顯示,雜交瘤(1C8)培養(yǎng)上清和腹水與重組蛋白VP73具有較強(qiáng)的反應(yīng)性,而不與含pET-32a(+)空質(zhì)粒表達(dá)的菌體蛋白反應(yīng)(表1)。

    表1 單抗(1C8)特異性分析Table 1 Specificities of MAb tested by indirect ELISA

    2.4.2 Western blot檢測結(jié)果 蛋白檢測結(jié)果顯示,該株MAb可特異性識別非洲豬瘟病毒重組VP73蛋白,而不與含pET-32a(+)空質(zhì)粒表達(dá)的菌體蛋白反應(yīng)(圖4)。

    圖4 腹水單抗的Western blot檢測Fig.4 Western blot analysis of the monoclonal antibody in ascites

    2.4.3 腹水效價(jià)及抗體亞類鑒定結(jié)果 1C8的腹水抗體效價(jià)達(dá)到1.024×105??贵w亞類鑒定結(jié)果表明,該MAb抗體類型為IgG1亞類。

    3 討論

    ASFV基因組是大分子線狀雙鏈DNA,通過雙向凝膠電泳證實(shí)ASFV粒子大約含有50種蛋白質(zhì),這些蛋白是構(gòu)成ASFV粒子結(jié)構(gòu)的主要成分。VP73蛋白是ASFV主要結(jié)構(gòu)蛋白之一,在病毒粒子中含量最大,且被證明具有較強(qiáng)的抗原性。VP73參與了病毒的吸附過程,針對VP73的抗體可以阻斷病毒與巨噬細(xì)胞的結(jié)合。

    本研究原核表達(dá)了VP73蛋白基因主要抗原表位區(qū),通過免疫印跡分析法驗(yàn)證了該融合蛋白具有良好的反應(yīng)原性,在此基礎(chǔ)上以該蛋白作為抗原免疫小鼠,最終獲得了一株穩(wěn)定分泌抗體的雜交瘤細(xì)胞株1C8。ELISA和Western blot檢測結(jié)果表明,所制備的MAb具有較強(qiáng)的特異性,有較高的抗體效價(jià)。

    國外有研究表明,雖然ASFV基因中負(fù)責(zé)免疫逃避機(jī)制的基因序列已經(jīng)確定[15-16],疫苗的研制也出現(xiàn)了一定的轉(zhuǎn)機(jī),但是短期內(nèi)成功制備有效的疫苗仍有一定困難[12]。而最近五年來,ASF一直在歐亞大陸接壤的高加索地區(qū)三國以及俄羅斯聯(lián)邦的部分地區(qū)肆虐,給當(dāng)?shù)氐酿B(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的損失[12];我國北方的生態(tài)環(huán)境和動物分布與ASF流行地區(qū)相似,ASF對我國威脅很大??狗侵挢i瘟病毒VP73蛋白MAb的成功制備,為隨后建立快速準(zhǔn)確的ASFV血清學(xué)檢測方法奠定了基礎(chǔ)。

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