攜帶PCV-2ORF2的感染性PRRSV克隆在Marc-145細胞表達的研究

鄭海紅，張可煜，周 艷，袁世山＊

（1.中國農(nóng)業(yè)科學院上海獸醫(yī)研究所動物傳染病研究室，上海200232；2.中國農(nóng)業(yè)科學院上海獸醫(yī)研究所動物藥學研究室，上海200232）

豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）是動脈炎病毒科（Arteriviridae）成員之一［1］。該病毒主要引起母豬流產(chǎn)、死胎、產(chǎn)弱仔、木乃伊胎等繁殖障礙以及仔豬與育肥豬的呼吸道疾病。豬體一旦感染了該病毒，往往為其他病毒侵入機體打開了通道，引發(fā)混合感染并進而造成更為嚴重的疾病甚至死亡［2-3］。豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS）的流行給中國乃至世界養(yǎng)豬業(yè)都帶來巨大經(jīng)濟損失。

為研制能防控PRRS的標識弱毒苗以及防控PRRS與其他病毒病的二聯(lián)苗或多價苗，眾多學者都試圖把PRRSV作為穩(wěn)定表達外源基因的載體。然而，多年來的研究表明，利用PRRSV作為載體表達外源基因，外源序列常常被逐步刪除［4-5］，且這種刪除現(xiàn)象在動脈炎病毒具有共性。有報道提出動脈炎病毒刪除外源序列可能與外源序列的插入導(dǎo)致所插入位置及轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列（transcription regulation sequence，TRS）的二級結(jié)構(gòu)改變有關(guān)，同時還可能與外源序列的長度及其自身特性相關(guān)［6-10］。然而，更為詳盡的機制卻尚未闡明，因而無法在實踐中指導(dǎo)構(gòu)建能穩(wěn)定表達外源序列的動脈炎重組病毒。

就PRRSV而言，若直接在基因組上插入外源序列而不對PRRSV基因組進行改造，外源序列常常缺失［4-5］；而若能對PRRSV基因組進行恰當?shù)娜笔В迦隩RS等改造，則插入的外源序列則往往具有遺傳穩(wěn)定性［11-12］。據(jù)此，本研究借助前期構(gòu)建的感染性克隆pCPV［5］為平臺進行反向遺傳操作，構(gòu)建了含有部分Nsp2序列缺失的全長cDNA克隆，并進行了病毒的拯救和一系列遺傳穩(wěn)定性分析，為進一步探索和闡明PRRSV刪除外源序列的機制，以及研制PRRSV標識性弱毒苗或PRRSV與其他病毒的二聯(lián)苗或多價苗提供理論和物質(zhì)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞 MARC-145由中國農(nóng)業(yè)科學院上海獸醫(yī)研究所豬病實驗室提供。細胞生長液為含100 mL／L胎牛血清（FBS，Gibco-BRL Cat＃16000）的DMEM（Gibco-BRL Cat＃12430），維持液為含20 mL／L FBS的DMEM。

1.1.2 引物 參照PRRSV基因組序列（GenBank accession number＃GQ330474），利用Primer 5.0軟件設(shè)計引物，由上海英俊技術(shù)有限公司合成（表1）。

1.2 方法

1.2.1 重組全長cDNA的構(gòu)建 全長感染性克隆pCPV由筆者構(gòu)建并保存［5，13］，并將含全長Nsp2的片段從感染性克隆pAPRRS［14］上用KpnⅠ酶切下來，連接到已被KpnⅠ預(yù)處理的pBlueScript SK（＋）載體上，構(gòu)建中間模板質(zhì)粒pDnsp2。以pDnsp2為模板，采用Site-direct PCR方法進行Nsp2 108nt的缺失，將獲得的PCR產(chǎn)物用DpnⅠ消化過夜后，直接轉(zhuǎn)化。測序正確的中間陽性質(zhì)粒命名為pDnsp2。將其與全長感染性克隆pCPV用KpnⅠ酶切，回收相應(yīng)酶切產(chǎn)物后，用含有Nsp2缺失108nt的片段替代pCPV相應(yīng)片段，構(gòu)建全長突變體pDCPV，并用酶切及測序方法鑒定pDCPV（圖1）。

圖1 突變體pDCPV構(gòu)建示意圖Fig.1 Schematic representation of the procedures for construction of mutant pDCPV

1.2.2 DNA轉(zhuǎn)染 用Qiagen公司的QIAprep Spin Miniprep kit（QIAgen Inc.）試劑盒提取突變體質(zhì)粒pCPV和pDCPV，采用分光光度計測定各質(zhì)粒濃度，確定轉(zhuǎn)染體積，保證轉(zhuǎn)染量為1μg DNA。將Marc-145細胞接種于6孔細胞培養(yǎng)板中，待細胞密度為80%左右時進行轉(zhuǎn)染。將DNA按FuGENE?HD轉(zhuǎn)染試劑（Roche）的轉(zhuǎn)染方法轉(zhuǎn)染Marc-145細胞，置37℃體積分數(shù)為5% 的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)觀察。轉(zhuǎn)染細胞后每天觀察細胞，待細胞出現(xiàn)病變且病變達80%左右收取細胞上清（P0病毒上清）保存于-70℃。

1.2.3 病毒基因組RNA的提取及其鑒定 將收集的原代病毒細胞上清中的病毒基因組按Qiagen公司的QIAgen Viral RNA Mini Kit說明提取病毒RNA并懸于無核酸酶的水中。按寶生物工程（大連）有限公司的AMV和LA Taq說明書進行RTPCR，引物見表1，回收目的條帶亞克隆后送上海英駿生物技術(shù)有限公司測序。

1.2.4 重組病毒的空斑純化及其鑒定 依照病毒純化方法［15］，將得到的P0病毒，純化1次，并用RT-PCR鑒定出外源序列PCV-2ORF2不被刪除的重組病毒［5］，并且將含有完整PCV-2ORF2序列的重組病毒繼續(xù)純化2次。將第3次純化病毒的細胞上清液以0.01MOI，連續(xù)在Marc-145細胞上傳代10次，收取每代病毒上清，保存于-70℃?zhèn)溆?。提取?0代次的病毒RNA并懸于無核酸酶的水中，進行RT-PCR（參照1.2.3），鑒定重組病毒是否具有遺傳穩(wěn)定性。

1.2.5 空斑形態(tài) 將P0病毒懸液作連續(xù)遞進1 000倍稀釋，取200μL接種于已經(jīng)長成單層的Marc-145細胞上37℃孵育1h后，做3個重復(fù)，其中一孔用來挑取空斑，進行純化病毒，另兩孔做空斑形態(tài)分析。將20g／L瓊脂糖與2×DMEM以1∶1混合加到六孔板中，5mL／孔。室溫凝固后，在37℃恒溫箱倒置培養(yǎng)5d～6d。待出現(xiàn)空斑后，直接用50g／L結(jié)晶紫染色即可觀察空斑形態(tài)。

表1 RT及PCR引物Table 1 Primers used for PCR and RT

2 結(jié)果

2.1 構(gòu)建的全長cDNA克隆及拯救的重組病毒

經(jīng)Site-direct PCR構(gòu)建的中間陽性質(zhì)粒pDnsp2經(jīng)KpnⅠ單酶切后獲得目的片段取代pCPV［5］中相應(yīng)區(qū)域，經(jīng)部分測序鑒定構(gòu)建的重組全長cDNA克隆pDCPV（圖2）構(gòu)建成功。全長克隆pDCPV和pCPV［5］轉(zhuǎn)染Marc-145細胞，轉(zhuǎn)染至第5天左右出現(xiàn)細胞病變且待細胞病變達80%左右收取細胞上清，并視為P0病毒上清，將拯救病毒依次命名為vDCPV 和vCPV［5］。

圖2 全長突變體pDCPV的構(gòu)建Fig.2 Construction of the full-length mutant pDCPV

2.2 拯救的病毒vDCPV

拯救病毒P0vDCPV和vCPV細胞上清，RTPCR檢測結(jié)果顯示（圖3），擴增vCPV的目的片段分子質(zhì)量均小于預(yù)測分子質(zhì)量（1 868bp），即所插入的外源序列PCV-2ORF2有刪除，與以前結(jié)果一致［5］，而擴增vDCPV的目的片段分子質(zhì)量大小不一，將目的片段克隆測序分析發(fā)現(xiàn)，分子質(zhì)量偏小兩條（標記為b，c帶）目的片段中的PCV-2ORF2與vCPV一樣有刪除現(xiàn)象，而分子質(zhì)量最大目的片段（標記為a帶）中PCV-2ORF2保持完整。表明Nsp2的3 775nt～3 882nt缺失有利于重組病毒中的PCV-2ORF2穩(wěn)定。

2.3 純化病毒的遺傳穩(wěn)定性

圖3 RT-PCR鑒定vCPV、vDCPV原代上清中的病毒基因組Fig.3 RT-PCR amplification of the genomic RNA of the P0vCPV，vDCPV

將得到的重組病毒P0vDCPV純化1次，空斑形態(tài)見圖4（3個重復(fù)孔的第1、2孔做空斑形態(tài)分析），可見2個重復(fù)孔中的空斑形態(tài)大小不同。挑取第3孔中的7個形態(tài)不一的空斑，在細胞上增殖病毒后，經(jīng)RT-PCR擴增目的條帶（圖5A）后克隆測序得知，所挑取的形成7個空斑病毒中有一個空斑的病毒含有完整的PCV-2ORF2，即形成第6個空斑的病毒，并把這株重組病毒命名為vDCPVP，而形成其余空斑的病毒中PCV-2ORF2均有刪除。將vDCPVP繼續(xù)純化2次，經(jīng)RT-PCR鑒定，病毒基因組中PCV-2ORF2穩(wěn)定存在（圖5B）。將第3次純化病毒的細胞上清液以0.01MOI，連續(xù)在Marc-145細胞上傳代10次，提取第10代次的病毒RNA，進行RT-PCR（圖5B），經(jīng)核酸序列分析表明，外源序列PCV-2ORF2穩(wěn)定地存在于至少10代子代病毒中。

圖4 病毒的空班形態(tài)分析Fig.4 Analysis of the plague form of mutant virus

圖5 RT-PCR鑒定純化病毒vDCPVP中的PCV-2ORF2遺傳穩(wěn)定性Fig.5 RT-PCR amplification of the PCV-2ORF2 of purified virus vDCPVP

2.4 純化病毒vDCPVP表達PCV-2cap蛋白

在vDCPVP感染Marc-145時，待出現(xiàn)微弱細胞病變，進行IFA，用PCV-2cap特異抗體檢測cap蛋白的表達情況（圖6），發(fā)現(xiàn)cap蛋白微量表達。

圖6 IFA檢測到cap蛋白微弱表達Fig.6 Cap protein can be expressed slightly for vDCPVP identified by IFA

3 討論

前期研究表明，以北美PRRSV株為表達載體，不對Nsp2區(qū)域進行部分核苷酸缺失，在ORF1和ORF2間插入PCV-2的主要免疫原開放閱讀框架（open reading frame，ORF）及兩個酶切位點，獲得的拯救病毒中的外源序列存在遺傳不穩(wěn)定性［5］。本研究結(jié)果顯示，Nsp2區(qū)域缺失一段核苷酸（108nt）后不僅能拯救出病毒而且拯救的病毒經(jīng)一系列空斑純化，能純化出含有完整PCV-2ORF2的重組病毒，這與以前Nsp2區(qū)域沒有缺失獲得的拯救病毒形成了鮮明對比，由此，直接證實了重組病毒存在遺傳不穩(wěn)定性是源于外源序列的插入導(dǎo)致全長基因組過長，由此影響了N蛋白與基因組作用及其他結(jié)構(gòu)蛋白包裝過程。

在動脈炎病毒科所有病毒中存在N蛋白分子量越大，則相應(yīng)的基因組越大的規(guī)律［1］。由此推測，不對北美PRRSV株基因組進行缺失改造，僅插入PCV-2ORF2及2個酶切位點（712bp），過長外源序列插入使整個重組病毒基因組過長以致影響了N蛋白對重組病毒基因組的包裝，進而影響其他結(jié)構(gòu)蛋白的包裝直至最終影響了整個病毒粒子的包裝。在這種選擇壓力下，PRRSV通過刪除外源序列的方式來獲得最佳的生存條件，由此獲得的重組病毒具有遺傳不穩(wěn)定性。因此，在本研究中嘗試了對基因組的缺失改造，選擇Nsp2區(qū)作為缺失對象源于，一是有研究證明Nsp2存在復(fù)制非必需區(qū)［10］，二是本研究采用的毒株APRRSV株比其他北美PRRSV經(jīng)典毒株長108 nt。通過缺失Nsp2區(qū)多出的108nt，使得重組病毒全長基因組越接近于野生的北美PRRSV基因組，利于N蛋白對基因組的包裝及其他蛋白的包裝過程，獲得的重組病毒也具有遺傳穩(wěn)定性。當然，不能否認重組病毒中仍有部分重組病毒存在遺傳不穩(wěn)定性，這可能是由于所缺失區(qū)域仍太短導(dǎo)致。

Calvert等和Pei等分別以北美PRRSV P129株的感染性克隆為操作平臺，同樣在ORF1和ORF2間分別插入綠色熒光蛋白（GFP）及兩個酶切位點、PCV-2的主要免疫原開放閱讀框架（ORF）及兩個酶切位點。在此基礎(chǔ)上，Calvert和Pei還在插入的外源序列和PRRSV ORF2之間額外引入了TRS6啟動子序列。結(jié)果顯示，都能獲得具有遺傳穩(wěn)定性的重組病毒。鑒于以上結(jié)果，Calvert等認為只在PRRSV ORF1和ORF2間進行外源序列插入，而不加入額外啟動子會影響PRRSV本身的ORF2正常轉(zhuǎn)錄［16-17］，所獲得的重組病毒存在遺傳不穩(wěn)定性；而加入一個額外啟動子，不僅可以讓PRRSV本身的TRS2來啟動外源序列的轉(zhuǎn)錄，而且額外引入的TRS6可以來啟動PRRSV ORF2轉(zhuǎn)錄，從而不會影響PRRSV正常的轉(zhuǎn)錄，所獲得的重組病毒就具有遺傳穩(wěn)定性。由此可見Calvert等闡釋的PRRSV穩(wěn)定表達外源基因的機制與本研究的結(jié)論不完全一致。究其緣由，一是Calvert等所用的病毒載體是P129株，相應(yīng)的Nsp2比本研究所采用的APRRS株恰缺少本研究缺失掉的核苷酸，這可能是Calvert等能獲得穩(wěn)定病毒的主要原因，而不是影響到了轉(zhuǎn)錄導(dǎo)致的遺傳不穩(wěn)定性；筆者先前的研究中發(fā)現(xiàn)，在沒有引入外源的TRS6時，PRRSV可以利用外源序列上的一段序列作為啟動子來形成一些亞基因組，并且通過分析發(fā)現(xiàn)這些亞基因組發(fā)現(xiàn)其極大可能被病毒用以翻譯PRRSV E或GP2b蛋白［5］，由此更進一步說明插入TRS6與否對PRRSV ORF2的正常轉(zhuǎn)錄沒有影響。因此，PRRSV刪除外源序列的最主要機制是源于外源序列的插入導(dǎo)致病毒基因組過長，由此影響到N蛋白與基因組作用及其他結(jié)構(gòu)蛋白包裝過程。

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