Snail在乳腺癌中的表達(dá)及其與上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的關(guān)系

劉志容，吳誠(chéng)義

上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）是上皮細(xì)胞在與細(xì)胞外因子相互作用過程中因喪失極性及細(xì)胞間緊密連接而獲得移行和游走能力，轉(zhuǎn)化為具有間質(zhì)特性細(xì)胞的過程。它不僅是多細(xì)胞生物胚胎發(fā)育的基礎(chǔ)過程，更與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展和侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[1-3]。同樣借助 EMT 方式，乳腺癌惡性腫瘤細(xì)胞的遷移和運(yùn)動(dòng)能力亦可明顯增強(qiáng)，從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)展與侵襲轉(zhuǎn)移。為此，本研究通過檢測(cè)細(xì)胞表面 EMT 相關(guān)標(biāo)記物 E-cadherin、Vimentin 及其調(diào)控因子Snail 在正常乳腺組織、乳腺癌癌旁組織及乳腺癌組織的表達(dá)情況，以探討 Snail 蛋白及其調(diào)控的EMT 與乳腺癌發(fā)生發(fā)展及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的相關(guān)性，以及 Snail 蛋白作為乳腺癌治療關(guān)鍵靶點(diǎn)的潛在意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標(biāo)本來源 正常乳腺組織取自本院內(nèi)分泌乳腺外科 2010 年 5 – 6 月 20 例女性乳腺良性病變患者微創(chuàng)手術(shù)的切緣標(biāo)本?；颊吣挲g 20～50 歲，平均 35 歲。

乳腺癌組織及乳腺癌癌旁組織取自本院內(nèi)分泌乳腺外科 2010 年 1 – 6 月 60 例女性乳腺癌患者改良根治術(shù)的切除標(biāo)本，并經(jīng)常規(guī)病理學(xué)檢查證實(shí)均為非特殊性浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌；60 例患者中20 例同時(shí)取癌組織邊緣 2～5 cm 的癌旁組織?；颊吣挲g 34～84 歲，平均 54 歲。

1.1.2 主要試劑 兔抗人 Snail、E-cadherin、Vimentin 多克隆抗體及生物素標(biāo)記的羊抗兔 IgG抗體均購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；鏈霉素親和素-過氧化酶復(fù)合物法（SP）免疫組織化學(xué)試劑盒、二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)記蛋白表達(dá)的檢測(cè) 手術(shù)切除標(biāo)本離體后均立即取材，經(jīng) 4% 甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，制成 5 μm 厚連續(xù)切片 4 張，其中 1 張用于 HE染色復(fù)核病理診斷，其余 3 張分別用于 Snail、E-cadherin、Vimentin 免疫組織化學(xué) SP 法染色。Snail 與 E-cadherin 抗體工作液濃度均為 1∶50，Vimentin 抗體工作液濃度為 1∶100，二抗為生物素標(biāo)記的羊抗兔 IgG 抗體。按試劑盒說明書操作步驟進(jìn)行染色，石蠟包埋切片經(jīng)二甲苯脫蠟及梯度乙醇逐步水化后，采用 0.01 mmol/L 的枸櫞酸緩沖液高溫抗原熱修復(fù) 15 min，冷卻至室溫。3% H2O2浸泡 10 min，山羊血清孵育 30 min，依次滴加一抗4 ℃ 過夜，二抗 37 ℃ 放置 30 min，滴加 SP，37 ℃ 放置 30 min，DAB 顯色，蘇木精復(fù)染，脫水封片。PBS 代替一抗作陰性對(duì)照，均以已知陽性組織切片作為陽性對(duì)照。

1.2.2 結(jié)果判斷 每張切片在高倍鏡下（× 400）隨機(jī)選取 5 個(gè)視野，鏡下觀察細(xì)胞的染色強(qiáng)度和廣度（即陽性細(xì)胞比例）。

1.2.2.1 Snail 蛋白 以細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色染色顆粒為 Snail 蛋白表達(dá)陽性。染色強(qiáng)度評(píng)分：0 分，無染色；1 分，弱陽性；2 分，強(qiáng)陽性。染色廣度評(píng)分：1 分，1%～25 %；2 分，26%～50%；3 分，51%～75%；4 分，76%～100%。根據(jù)染色強(qiáng)度和廣度的乘積判定各標(biāo)本積分，積分分級(jí)：1～2 分為陰性；3～8 分為陽性[4]。

1.2.2.2 E-cadherin、Vimentin 蛋白 以細(xì)胞膜或細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色染色顆粒為 E-cadherin 蛋白表達(dá)陽性，以細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色染色顆粒為Vimentin 蛋白表達(dá)陽性。E-cadherin 蛋白表達(dá)陽性染色廣度評(píng)分：≤ 90% 判定為 E-cadherin 蛋白表達(dá)降低；＞ 90% 判定為 E-cadherin 蛋白表達(dá)保留。Vimentin 蛋白表達(dá)陽性染色廣度評(píng)分：≤ 20% 判定為 Vimentin 蛋白低表達(dá)；＞ 20% 判定為Vimentin 蛋白高表達(dá)[5]。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用 SPSS17.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。組間實(shí)驗(yàn)檢測(cè)數(shù)據(jù)的比較采用 χ2檢驗(yàn)，相關(guān)性研究采用 Spearman 等級(jí)相關(guān)分析，以 P ＜ 0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Snail 蛋白表達(dá)

鏡下觀察可見 Snail 蛋白主要定位表達(dá)于細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，也可見于部分細(xì)胞的細(xì)胞核，呈棕黃色染色顆粒。Snail 蛋白在正常乳腺組織、乳腺癌癌旁組織、乳腺癌組織中表達(dá)的陽性率分別為0、30.0%、53.3%，并隨著乳腺組織癌變的發(fā)展而逐漸遞增；3 種組織中 Snail 蛋白的表達(dá)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2= 18.789，P = 0.000）（表 1、圖 1）。

2.2 Vimentin 和E-cadherin 蛋白表達(dá)

鏡下觀察可見 Vimentin 蛋白在正常乳腺組織中不表達(dá)，其主要定位表達(dá)于腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，呈棕黃色染色顆粒。Vimentin 蛋白在正常乳腺組織、乳腺癌癌旁組織、乳腺癌組織中表達(dá)的陽性率分別為 0、40.0%、63.3%，且隨著乳腺組織癌變的發(fā)展，Vimentin 表達(dá)亦逐漸增強(qiáng)；3 種組織中 Vimentin 蛋白的表達(dá)差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2= 24.584、P = 0.000）（表 2、圖 2）。

表1 Snail 蛋白在乳腺癌組織中的表達(dá)Table 1 Expression of Snail protein in breast cancer tissues

圖1 乳腺癌組織中 Snail 蛋白表達(dá)的免疫組織化學(xué)檢測(cè)（A：正常乳腺組織中 Snail 蛋白呈陰性表達(dá) SP × 400；B：乳腺癌癌旁組織中 Snail 蛋白呈弱陽性表達(dá) SP × 400；C：乳腺癌組織中 Snail 蛋白呈強(qiáng)陽性表達(dá) SP × 200）Figure 1 Immunohistochemical detection of the expression of Snail protein in breast cancer tissues.A: The negative expression of Snail protein in normal breast tissue (SP × 400); B: The weakly positive expression of Snail protein in adjacent tissue of breast cancer(SP × 400); C: The strongly positive expression of Snail protein in breast cancer tissue (SP × 200)

鏡下觀察可見 E-cadherin 蛋白主要定位表達(dá)于細(xì)胞的細(xì)胞膜或細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，呈棕褐色染色顆粒。E-cadherin 蛋白在正常乳腺組織、乳腺癌癌旁組織和乳腺癌組織中表達(dá)的陽性率分別為 100.0%、75.0%、56.7%，且隨著乳腺組織的癌變及轉(zhuǎn)移，E-cadherin 蛋白表達(dá)逐漸減少，而其在乳腺癌細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)部位也隨之發(fā)生相應(yīng)改變，表現(xiàn)為主要定位表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)，而細(xì)胞膜則不明顯；3 種組織中E-cadherin 蛋白的表達(dá)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=13.589、P = 0.001）（表 2、圖 2）。

2.3 Snail 和E-cadherin、Vimentin 表達(dá)的相關(guān)性

隨著正常乳腺組織癌變的發(fā)展，Snail 蛋白表達(dá)逐漸增強(qiáng)，Vimentin 蛋白表達(dá)也逐漸上調(diào)，而E-cadherin 蛋白表達(dá)則呈減少趨勢(shì)。Spearman 等級(jí)相關(guān)分析表明：① Snail 蛋白表達(dá)與 E-cadherin 蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（r = –0.413、P = 0.001）；② Snail 蛋白表達(dá)與 Vimentin 蛋白表達(dá)呈顯著正相關(guān)（r =0.536、P = 0.000）；③在 3 種組織中，隨著上皮標(biāo)記物 E-cadherin 蛋白表達(dá)的降低，間質(zhì)標(biāo)記物Vimentin 蛋白表達(dá)逐漸增高，兩者的表達(dá)差異呈顯著負(fù)相關(guān)（r = –0.526、P = 0.000，表 3）。

表2 E-cadherin、Vimentin 蛋白在乳腺癌組織中的表達(dá)Table 2 Expression of E-cadherin and Vimentin protein in breast cancer tissues

圖2 乳腺癌組織中 E-cadherin、Vimentin 蛋白表達(dá)的免疫組織化學(xué)檢測(cè) SP × 400（A：正常乳腺組織中 Vimentin 蛋白呈陰性表達(dá)；B：乳腺癌癌旁組織中 Vimentin 蛋白呈弱陽性表達(dá)；C：乳腺癌組織中 Vimentin 蛋白呈強(qiáng)陽性表達(dá)；D：正常乳腺組織中 E-cadherin 蛋白呈強(qiáng)陽性表達(dá)；E：乳腺癌癌旁組織中 E-cadherin 蛋白呈弱陽性表達(dá)；F：乳腺癌組織中E-cadherin 蛋白呈極弱陽性表達(dá)）Figure 2 Immunohistochemical detection of the expression of E-cadherin and Vimentin protein in breast cancer tissues (SP × 400).A: The negative expression of Vimentin protein in normal breast tissue; B: The weakly positive expression of Vimentin protein in adjacent tissue of breast cancer; C: The strongly positive expression of Vimentin protein in breast cancer tissue; D: The strongly positive expression of E-cadherin protein in normal breast tissues; E: The weakly positive expression of E-cadherin protein in adjacent tissue of breast cancer; F: The very weakly positive expression of E-cadherin protein in breast cancer tissue

表3 乳腺癌組織中 Snail 與 E-cadherin、Vimentin 蛋白表達(dá)強(qiáng)度的 Spearman 相關(guān)分析Table 3 The Spearman correlation analysis among expression intensity of Snail, E-cadherin and Vimentin protein in breast cancer tissues

表4 Snail 蛋白表達(dá)與乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的相關(guān)性Table 4 The Spearman correlation analysis between expression of Snail protein and lymph node metastasis in breast cancer tissues

2.4 Snail 蛋白表達(dá)和乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的相關(guān)性

在 60 例乳腺癌組織標(biāo)本中，其中 32 例Snail 蛋白表達(dá)陽性，Snail 蛋白表達(dá)陽性率為53.3%（32/60）。在 32 例 Snail 蛋白表達(dá)陽性的乳腺癌組織標(biāo)本中，28 例伴有腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（87.5%，28/32），4 例未見淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移；而在 28 例Snail 蛋白表達(dá)陰性的乳腺癌組織標(biāo)本中，僅有 8

例伴有腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（28.6%，8/28）。Spearman 等級(jí)相關(guān)分析表明，Snail 蛋白在乳腺癌組織中表達(dá)的陽性率與有無腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)（r =0.600、P = 0.000，表 4）。

3 討論

乳腺癌惡性腫瘤細(xì)胞 EMT 在腫瘤細(xì)胞對(duì)原發(fā)部位的浸潤(rùn)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移過程中具有重要作用。EMT 過程中一個(gè)重要的分子事件就是鈣黏蛋白表達(dá)的異常，其中上皮標(biāo)記物 E-cadherin 蛋白和間質(zhì)標(biāo)記物 Vimentin 蛋白即為腫瘤轉(zhuǎn)移過程中最具代表性的兩種類型鈣黏蛋白[6-8]。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，在正常乳腺組織、乳腺癌癌旁組織和乳腺癌組織中 E-cadherin 蛋白的表達(dá)逐漸減少（100%、75%、56.7%），3 種組織間 E-cadherin 蛋白的表達(dá)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜ 0.05）。而 E-cadherin 蛋白在表達(dá)減少的同時(shí)，其在乳腺癌細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)部位也隨之發(fā)生了相應(yīng)改變，表現(xiàn)為主要定位表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)，而細(xì)胞膜則不明顯，這可能是因?yàn)榇藭r(shí)E-cadherin 蛋白雖在細(xì)胞內(nèi)仍可合成表達(dá)，但卻不能良好的表達(dá)于細(xì)胞膜，導(dǎo)致其無法發(fā)揮應(yīng)有的黏附作用，使細(xì)胞間黏附力下降，提示在正常乳腺組織向癌組織的轉(zhuǎn)變發(fā)展過程中，細(xì)胞間黏附性的逐漸下降可明顯增加腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力。

有研究表明，間質(zhì)標(biāo)記物 Vimentin 蛋白表達(dá)的增加和腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移特性具有普遍聯(lián)系[9]。而本研究結(jié)果顯示，隨著正常乳腺組織、乳腺癌癌旁組織至乳腺癌組織的轉(zhuǎn)變發(fā)展，Vimentin 蛋白的表達(dá)亦逐漸增強(qiáng)（0、40%、63.3%），3 種組織間Vimentin 蛋白表達(dá)的差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P= 0.000），驗(yàn)證了 Vimentin 蛋白表達(dá)的增加與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。同時(shí) E-cadherin 和Vimentin 蛋白表達(dá)強(qiáng)度的相關(guān)性分析結(jié)果還表明，在乳腺正常組織的癌變過程中，E-cadherin 蛋白表達(dá)逐漸減少，而 Vimentin 蛋白表達(dá)則逐漸增加，兩者表達(dá)呈明顯負(fù)相關(guān)（P ＜ 0.05），更進(jìn)一步證實(shí)了乳腺癌生長(zhǎng)過程中存在上皮向間質(zhì)轉(zhuǎn)化的現(xiàn)象。因此，檢測(cè) EMT 過程中兩種重要蛋白 E-cadherin和Vimentin 在乳腺癌組織中的表達(dá)及變化情況，可有助于了解乳腺癌組織中 EMT 的發(fā)生及進(jìn)展，進(jìn)而判斷惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展能力。

Snail 蛋白是一類鋅指轉(zhuǎn)錄因子，近來因發(fā)現(xiàn)其高表達(dá)與許多腫瘤發(fā)生發(fā)展的 EMT 過程有關(guān)而備受關(guān)注，認(rèn)為 Snail 蛋白是EMT 過程中的關(guān)鍵調(diào)控因子[10-11]。本研究對(duì)乳腺癌組織中 Snail 蛋白的表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)，在正常乳腺組織、乳腺癌癌旁組織和乳腺癌組織中 Snail 蛋白表達(dá)逐漸增強(qiáng)（0、30%、53.3%，P ＜ 0.05），表明Snail蛋白表達(dá)的增加與乳腺組織的癌變明顯相關(guān)。在此基礎(chǔ)上，對(duì) Snail 與 E-cadherin、Vimentin 蛋白表達(dá)強(qiáng)度的相關(guān)性研究結(jié)果還表明，Snail 蛋白表達(dá)增加的同時(shí)還呈現(xiàn) Vimentin 蛋白表達(dá)逐漸上調(diào)而E-cadherin 蛋白表達(dá)逐漸減少的趨勢(shì)，這提示 Snail蛋白可能通過參與調(diào)控細(xì)胞標(biāo)記物 E-cadherin、Vimentin 蛋白的表達(dá)而觸發(fā) EMT，使腫瘤細(xì)胞失去黏附能力，原發(fā)灶腫瘤細(xì)胞脫落分離，向局部浸潤(rùn)，并進(jìn)一步向淋巴結(jié)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，從而在乳腺癌的發(fā)展、侵襲和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用。2005 年，Moody 等[12]在乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌中發(fā)現(xiàn)了 Snail 蛋白的表達(dá)，進(jìn)而提出 Snail 蛋白的表達(dá)與乳腺癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)存在相關(guān)性。而本實(shí)驗(yàn)在 Snail 蛋白表達(dá)與乳腺癌腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的相關(guān)性分析中也發(fā)現(xiàn)，32 例（32/60，53.3%）Snail 表達(dá)陽性的乳腺癌組織標(biāo)本中，Snail蛋白的表達(dá)與乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移具有明顯相關(guān)性：Snail 陽性表達(dá)患者腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率較高（87.5%，28/32），而 Snail 表達(dá)陰性者僅有 8 例伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（28.6%，8/28），其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜ 0.05），與 Moody 等研究結(jié)果相一致，證實(shí)了 Snail 蛋白可明顯促進(jìn)乳腺癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。綜上可以推測(cè)在 EMT 過程中，Snail 蛋白不僅是可調(diào)控乳腺癌發(fā)生發(fā)展和浸潤(rùn)過程的一個(gè)樞紐，而且其對(duì)乳腺癌的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移也具有重要的推動(dòng)作用。

[1]Wang Y, Zhou BP.Epithelial-mesenchymal transition in breast cancer progression and metastasis.Chin J Cancer, 2011, 30(9):603-611.

[2]Takebe N, Warren RQ, Ivy SP, et al.Breast cancer growth and metastasis: interplay between cancer stem cells, embryonic signaling pathways and epithelial-to-mesenchymal transition.Breast Cancer Res,2011, 13(3):211.

[3]Roy LD, Sahraei M, Subramani DB, et al.MUC1 enhances invasiveness of pancreatic cancer cells by inducing epithelial to mesenchymal transition.Oncogene, 2011, 30(12):1449-1459.

[4]Rosivatz E, Becker I, Specht K, et a1.Differentia1 expression of the epithelial-mesenchyal transition regulators snail, SlPl, and twist in gastric cancer.Am J Pathol, 2002, 161(5):1881-1891.

[5]Baumgart E, Cohen MS, Silva Neto B, et al.Identification and prognostic significance of an epithelial-mesenchymal transition expression profile in human bladder tumors.Clin Cancer Res, 2007,13(6):1685-1694.

[6]Nijkamp MM, Span PN, Hoogsteen IJ, et al.Expression of E-cadherin and vimentin correlates with metastasis formation in head and neck squamous cell carcinoma patients.Radiother Oncol, 2011, 99(3):344-348.

[7]Ivaska J.Vimentin: Central hub in EMT induction? Small Gtpases,2011, 2(1):51-53.

[8]Shah PP, Kakar SS.Pituitary tumor transforming gene induces epithelial to mesenchymal transition by regulation of Twist, Snail,Slug, and E-cadherin.Cancer Lett, 2011, 311(1):66-76.

[9]Sethi S, Macoska J, Chen W, et al.Molecular signature of epithelial-mesenchymal transition (EMT) in human prostate cancer bone metastasis.Am J Transl Res, 2010, 3(1):90-99.

[10]Yuen HF, Chan YK, Grills C, et al.Polyomavirus enhancer activator 3 protein promotes breast cancer metastatic progression through Snail-induced epithelial-mesenchymal transition.J Pathol, 2011,224(1):78-89.

[11]Argast GM, Krueger JS, Thomson S, et al.Inducible expression of TGFβ, Snail and Zeb1 recapitulates EMT in vitro and in vivo in a NSCLC model.Clin Exp Metastasis, 2011, 28(7):593-614.

[12]Moody SE, Perez D, Pan TC, et al.The transcriptional repressor Snail promotes mammary tumor recurrence.Cancer Cell, 2005, 8(3):197-209.