IGFBP7對(duì)人乳腺癌MCF－7細(xì)胞增殖的影響及其機(jī)制*

袁 磊，左曙光，范文娟，宋國(guó)華

(漯河醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校，河南 漯河 462002)

胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白(insulin－like growth factor binding proteins，IGFBPs)是一個(gè)能夠與胰島素樣生長(zhǎng)因子(insulin－like growth factor，IGF)結(jié)合的蛋白質(zhì)家族。根據(jù)與IGF親和力的高低可將IGFBP超家族分成兩類:高親和力IGFBPs(IGFBP1～6)和低親和力 IGFBPs(IGFBP7 ～ 10)[1]。與高親和力IGFBPs相比，低親和力IGFBPs與IGFs的親和力低5～25倍，這提示低親和力IGFBPs可能發(fā)揮一些與IGFBP家族其它成員不同的生物學(xué)作用。IGFBP7 是第一個(gè)被證實(shí)的低親和力 IGFBPs[2－3]。IGFBP7在正常人體多種組織、器官中廣泛表達(dá)，如心臟、脾臟、小腸、大腸、卵巢、乳腺等，然而在多種腫瘤組織中卻表達(dá)下調(diào)甚至缺失，如黑色素瘤、肝癌、肺癌、前列腺癌和乳腺癌等。IGFBP7在正常乳腺導(dǎo)管和小葉上皮細(xì)胞均有表達(dá)[4]，在衰老的乳腺上皮細(xì)胞中過(guò)表達(dá)(可達(dá)正常水平的10倍)[5]，但在乳腺癌組織中表達(dá)下降[6]，并且癌組織的侵襲力和惡性程度越高其表達(dá)越低[7]。因此IGFBP7可作為特異性標(biāo)志物用于乳腺腫瘤的病理學(xué)和血清學(xué)診斷。大量研究表明，IGFBP7可抑制多種腫瘤組織的生長(zhǎng)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的衰老和凋亡。本研究通過(guò)構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)IGFBP7的人乳腺癌MCF－7細(xì)胞，探究IGFBP7對(duì)人乳腺癌MCF－7細(xì)胞增殖的影響及其分子生物學(xué)機(jī)制。

材料和方法

1 動(dòng)物

MCF－7細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)，大腸桿菌菌株DH5α由學(xué)校分子醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心提供。

2 主要試劑

胎牛血清和RPMI－1640培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco;質(zhì)粒pCMV6－IGFBP7購(gòu)自O(shè)riGene;質(zhì)粒提取試劑盒、DNA純化試劑盒購(gòu)自北京天根公司;限制性核酸內(nèi)切酶Sgf I和Not I購(gòu)自大連寶生物公司;Effectene轉(zhuǎn)染試劑盒購(gòu)自Qiagen;兔抗人IGFBP7、細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2(extracellular signal－regulated protein kinases 1/2，ERK1/2)、p － ERK1/2、細(xì)胞周期素(cyclin)D1、cyclin E、細(xì)胞周期素依賴性激酶(cyclindependent kinase，CDK)2、CDK4、p21CIP1/WAF1、p27KIP1、p53、Rb、p－Rb抗體和辣根過(guò)氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)標(biāo)記的山羊抗兔 IgG購(gòu)自 Sigma;ECL顯色試劑盒購(gòu)自上海漢恒公司。

3 主要方法

3.1 質(zhì)粒pCMV6－IGFBP7的酶切鑒定及空質(zhì)粒制備 以DH5α大腸桿菌制備感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化質(zhì)粒pCMV6－IGFBP7，37℃過(guò)夜，挑取單菌落，置于含有氨芐青霉素(ampicillin，AMP)的 LB培養(yǎng)基中，37℃、200 r/min過(guò)夜。采用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒pCMV6－IGFBP7。將質(zhì)粒pCMV6－IGFBP7于37℃由限制性核酸內(nèi)切酶Sgf I和Not I酶切過(guò)夜，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后，采用DNA純化試劑盒回收瓊脂糖凝膠中pCMV6質(zhì)粒片段，先用T4 DNA聚合酶將質(zhì)粒片段末端平滑化，再經(jīng)T4連接酶連接后即為空質(zhì)粒pCMV6。

3.2 MCF－7細(xì)胞培養(yǎng) 用含10%胎牛血清的RPMI－1640培養(yǎng)基，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)MCF－7細(xì)胞，每隔48 h更換1次細(xì)胞培養(yǎng)液。待MCF－7細(xì)胞覆蓋瓶底達(dá)80%以上時(shí)，用0.125%胰蛋白酶消化傳代。實(shí)驗(yàn)前更換為不含胎牛血清的RPMI－1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

3.3 構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)IGFBP7的MCF－7細(xì)胞系 采用Effectene轉(zhuǎn)染試劑盒將質(zhì)粒pCMV6－IGFBP7和空質(zhì)粒pCMV6分別轉(zhuǎn)染入MCF－7細(xì)胞，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h后用PBS洗去轉(zhuǎn)染試劑，加入新鮮的培養(yǎng)基和G418(終濃度為0.5 g/L)，繼續(xù)培養(yǎng)2周，即可獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染子。

3.4 實(shí)驗(yàn)分組 實(shí)驗(yàn)分成4組，每組5個(gè)孔。Control組:正常培養(yǎng)的MCF－7細(xì)胞;empty組:穩(wěn)定轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒pCMV6的MCF－7細(xì)胞;IGFBP7組:穩(wěn)定轉(zhuǎn)染質(zhì)粒 pCMV6－IGFBP7的 MCF－7細(xì)胞;PD98059組:經(jīng) PD98059(終濃度為10 μmol/L)作用72 h的MCF－7細(xì)胞。

3.5 軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn) 將1.2%低熔點(diǎn)瓊脂糖與細(xì)胞培養(yǎng)基以1∶1的體積比混合制備0.6%的底層瓊脂，注入6孔板中，每個(gè)孔1.4 mL，溫室凝固備用。將細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后吹散成單個(gè)細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×107/L。將0.6%低熔點(diǎn)瓊脂糖與細(xì)胞培養(yǎng)基以1∶1的體積比混合，制備0.3%的上層瓊脂，向每孔加1 mL上層瓊脂和50 μL單細(xì)胞懸液(500 cells/well)，混勻，室溫凝固。置于37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3周，計(jì)數(shù)直徑大于100 μm的克隆，計(jì)算克隆形成率(colony－forming efficiency，CFE)，CFE(%)=克隆數(shù)/接種數(shù) ×100%。

3.6 細(xì)胞周期檢測(cè) 制備各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞懸液，用冷PBS洗滌細(xì)胞2次，加入1 mL 70%冰乙醇于4℃固定24 h，離心去除乙醇，再用冷PBS洗滌細(xì)胞2次，加入1 mL PI溶液(50 mg/L)，4℃避光染色30 min，送流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

3.7 Western blotting 裂解各組細(xì)胞提取總蛋白。用Bradford法測(cè)定蛋白濃度。將總蛋白經(jīng)SDSPAGE分離后轉(zhuǎn)移至PVDF膜。將PVDF膜移入含有封閉液(5%脫脂奶粉)的平皿中，室溫下封閉1 h后，分別加入Ⅰ抗(兔抗人 IGFBP7、ERK1/2、p－ERK1/2、 cyclin D1、 CDK4、 cyclin E、 CDK2、p21CIP1/WAF1、p27KIP1、p53、Rb 和 p － Rb 抗體)，4 ℃ 過(guò)夜。加入Ⅱ抗(HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG)室溫下孵育1 h，TBST洗膜3次，加入ECL顯色液顯色。運(yùn)用ImageJ軟件測(cè)定條帶灰度值，以p－Rb、p－ERK1/2條帶分別與Rb、ERK1/2條帶的灰度值之比衡量其的磷酸化水平，以 IGFBP7、cyclin D1、CDK4、cyclin E、CDK2、p21CIP1/WAF1、p27KIP1、p53 和 Rb 條帶分別與內(nèi)參照蛋白β－actin條帶的灰度值之比代表其蛋白表達(dá)水平。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示，多組間比較采用單因素方差分析(ANOVA)，組間兩兩比較采用最小顯著性差異法(LSD法)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 酶切質(zhì)粒pCMV6－IGFBP7及制備空質(zhì)粒

質(zhì)粒pCMV6－IGFBP7經(jīng)Sgf I和Not I酶切后，進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，全自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)檢測(cè)顯示，質(zhì)粒pCMV6－IGFBP7長(zhǎng)度為6 kb。酶切產(chǎn)生的pCMV6質(zhì)粒片段和IGFBP7片段長(zhǎng)度分別為4.9 kb和1.1 kb，與預(yù)期結(jié)果一致。空質(zhì)粒為4.9 kb，見圖1。

Figure1.Restriction endonuclease digestion of pCMV6－IGFBP7 and empty plasmid pCMV6.M:marker;A:pCMV6－IGFBP7;B:pCMV6－IGFBP7 digested by Sgf I and Not I;C:empty plasmid pCMV6.圖1 質(zhì)粒pCMV6－IGFBP7酶切結(jié)果與空質(zhì)粒pCMV6

2 IGFBP7的表達(dá)

Western blotting結(jié)果顯示，control組、empty組和PD98059組均不表達(dá)IGFBP7蛋白，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pCMV6－IGFBP7質(zhì)粒的IGFBP7組MCF－7細(xì)胞高表達(dá)IGFBP7蛋白，表明穩(wěn)定表達(dá)IGFBP7蛋白的細(xì)胞系構(gòu)建成功，見圖2。

Figure2.Expression of IGFBP7 protein in different groups.圖2 IGFBP7蛋白在各實(shí)驗(yàn)組中的表達(dá)

3 軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)

IGFBP7組細(xì)胞的CFE為2.92% ±0.36%，均顯著低于其它各組(P＜0.01)。PD98059組細(xì)胞的CFE為7.56% ±0.69%，顯著低于control組(P＜0.01)。Empty組CFE與control組相比無(wú)顯著差異，見圖3。

Figure3.Effect of IGFBP7 on colony－forming efficiency(CFE)of MCF－7 cells..n=5.△△P＜0.01 vs control and empty groups;##P＜0.01 vs PD98059 group.圖3 IGFBP7對(duì)人乳腺癌MCF－7細(xì)胞克隆形成率的影響

4 IGFBP7對(duì)細(xì)胞周期的影響

IGFBP7組G0/G1期細(xì)胞比例為77.69% ±2.17%，顯著高于其它各組(P＜0.01)，S期和G2/M細(xì)胞比例分別為13.66%±1.18%和8.65%±0.99%，均顯著低于其它各組(P＜0.01)。PD98059組G0/G1期細(xì)胞比例為66.03% ±2.04%，顯著高于control組(P＜0.01)，但明顯低于IGFBP7組(P＜0.01)，S期和 G2/M細(xì)胞比例分別為16.60% ±0.92%和17.37% ±1.12%，均顯著低于 control組(P＜0.05)。Empty組G0/G1期、S期和G2/M細(xì)胞比例與control組相比無(wú)顯著差異，見圖4。

5 IGFBP7對(duì)ERK磷酸化的影響

PD98059組p－ERK1/2與ERK1/2灰度比為0.0710±0.0059，均顯著低于其它各組(P＜0.01)。IGFBP7組p－ERK1/2與ERK1/2灰度比為0.2162±0.0168，明顯低于 control組，見圖5。

Figure4.Effect of IGFBP7 on cell cycle of MCF－7 cells measured by flow cytometry..n=5.△P＜0.05，△△P＜0.01 vs control and empty groups;##P＜0.01 vs PD98059 group.圖4 IGFBP7對(duì)人乳腺癌MCF－7細(xì)胞周期的影響

6 IGFBP7 對(duì) cyclin D1、CDK4、cyclin E、CDK2、p27KIP1、p21CIP1/WAF1、p53、Rb 和 p －Rb 蛋白表達(dá)的影響

IGFBP7組 cyclin D1/β－actin的灰度比為0.4518±0.0267，顯著低于 control組(P ＜0.01)，但與PD98059組相比無(wú)顯著差異，cyclin E/β－actin和p－Rb/Rb的灰度比分別為 0.4006±0.0161和0.1512±0.0095，顯著低于其它各組(P＜0.01)，p27KIP1/β －actin、p21CIP1/WAF1/β －actin 和 p53/β －actin的灰度比分別為 0.8744±0.0317、0.9229±0.0316和0.9481±0.0341，顯著高于其它各組(P＜0.01)。PD98059組 p27KIP1/β－actin的灰度比為0.7332±0.0301，顯著高于control組(P ＜0.01)，p－Rb/Rb的灰度比為0.3315±0.0194，顯著低于control組(P ＜0.01)，cyclin E/β －actin的灰度比為0.8924±0.0304，與 control組相比無(wú)顯著差異。Control組與empty組相比無(wú)顯著差異。各組CDK4/β －actin、CDK2/β －actin和 Rb/β －actin的灰度比無(wú)顯著差異，見圖6、7。

Figure5.IGFBP7 and PD98059 decreased the phosphorylation of ERK1/2..n=5.△△P＜0.01 vs control and empty groups;##P ＜0.01 vs PD98059 group.圖5 IGFBP7和PD98059抑制ERK1/2的磷酸化

Figure6.Effects of IGFBP7 on expression of cyclin D1，CDK4，cyclin E and CDK2 in MCF－7 cells..n=5.△△P＜0.01 vs control and empty groups;##P ＜0.01 vs PD98059 group.圖6 IGFBP7對(duì)cyclin D1、CDK4、cyclin E和CDK2蛋白表達(dá)的影響

討 論

RAS/RAF/MEK/ERK信號(hào)通路參與細(xì)胞增殖與分化、細(xì)胞形態(tài)維持、細(xì)胞骨架的構(gòu)建、細(xì)胞凋亡和細(xì)胞惡變等多種生物學(xué)反應(yīng)，是涉及調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、分化及分裂信號(hào)網(wǎng)絡(luò)的核心。大量來(lái)自生長(zhǎng)因子、絲裂原、環(huán)境刺激等信號(hào)可激活 RAS/RAF/MEK/ERK信號(hào)通路，通過(guò)信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)作用于核轉(zhuǎn)錄因子如AP－1、NF－кB等，調(diào)控基因表達(dá)。在許多人類的癌癥(如口腔癌、黑色素瘤、乳腺癌等)中都可發(fā)現(xiàn)ERK1/2信號(hào)通路的過(guò)度激活[8－9]。本研究結(jié)果顯示，人乳腺癌MCF－7細(xì)胞ERK1/2信號(hào)通路處于顯著活化狀態(tài)，而高表達(dá)IGFBP7可明顯抑制ERK1/2磷酸化，這可能與IGFBP7上調(diào)RAF激酶抑制蛋白(Raf kinase inhibitor protein，RKIP)有關(guān)[10]。

細(xì)胞增殖是通過(guò)細(xì)胞周期來(lái)完成的。細(xì)胞周期是多因子參與的高度精確和有組織的時(shí)序調(diào)控過(guò)程。細(xì)胞周期素(cyclins)、細(xì)胞周期素依賴性激酶(cyclin－dependent kinases，CDKs)和細(xì)胞周期素依賴性激酶抑制劑(cyclin－dependent kinase inhibitors，CDKIs)是細(xì)胞周期調(diào)控中的關(guān)鍵組分。Cyclin D1和cyclin E屬細(xì)胞周期素家族成員，可分別與CDK4和CDK2結(jié)合并激活其活性，調(diào)控細(xì)胞由G1期至S期的轉(zhuǎn)變。Rb是cyclin D/CDK4和cyclin E/CDK2激酶的一種重要底物。高度磷酸化的Rb與E2F轉(zhuǎn)錄因子解離，使E2F得以活化，從而激活一系列下游事件，其中包括DNA的復(fù)制，使細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期。CDKIs根據(jù)結(jié)構(gòu)和功能分為INK4家族和CIP/KIP家族。p21CIP1/WAF1和p27KIP1是CIP/KIP家族中的重要成員，它們可與G1/S期激酶復(fù)合物如cyclin D/CDK4和cyclin E/CDK2等緊密結(jié)合，抑制其活性，阻止細(xì)胞從 G1期進(jìn)入 S期，過(guò)表達(dá) p21CIP1/WAF1和p27KIP1均可使細(xì)胞停滯于 G1期[11－12]。

本研究發(fā)現(xiàn)，IGFBP7過(guò)表達(dá)既可顯著抑制人乳腺癌MCF－7細(xì)胞cyclin D1和cyclin E的表達(dá)，又同時(shí)促進(jìn)人乳腺癌 MCF－7細(xì)胞 p21CIP1/WAF1和p27KIP1蛋白表達(dá)，這樣不僅可以減少cyclin D1/CDK4和cyclin E/CDK2激酶復(fù)合物的形成，還能有效抑制已形成的cyclin D1/CDK4和cyclin E/CDK2激酶復(fù)合物的活性，從而抑制了Rb磷酸化和E2F活化，最終阻止人乳腺癌MCF－7細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期。

Figure7.Effects of IGFBP7 on expression of p21CIP1/WAF1，p27KIP1，p53，Rb and p－Rb in MCF－7 cells..n=5.△△P＜0.01 vs control and empty groups;##P ＜0.01 vs PD98059 group.圖7 IGFBP7對(duì)p21CIP1/WAF1、p27KIP1、p53、Rb和p－Rb蛋白表達(dá)的影響

本研究還發(fā)現(xiàn)，IGFBP7過(guò)表達(dá)可顯著抑制ERK1/2信號(hào)通路的活化。為了探究ERK1/2信號(hào)通路是否參與了IGFBP7的細(xì)胞周期阻滯作用，在本研究中我們使用了MEK1/2抑制劑PD98059以觀察ERK1/2信號(hào)通路對(duì)MCF－7細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PD98059誘導(dǎo)了一些與IGFBP7相似的作用，如阻滯MCF－7細(xì)胞于G1期，下調(diào)cyclin D1和上調(diào)p27KIP1的表達(dá)。這提示IGFBP7可能是通過(guò)抑制ERK1/2信號(hào)通路的活化影響cyclin D1和p27KIP1的表達(dá)，然而IGFBP7對(duì)p21CIP1/WAF1和cyclin E的表達(dá)調(diào)控似乎與ERK1/2信號(hào)通路無(wú)關(guān)。

為了進(jìn)一步探究IGFBP7對(duì)p21CIP1/WAF1的表達(dá)調(diào)控機(jī)制，我們觀察了IGFBP7對(duì)p21CIP1/WAF1上游基因p53的表達(dá)影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，IGFBP7可上調(diào)p53的表達(dá)。這提示IGFBP7可能是通過(guò)上調(diào)p53的表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)p21CIP1/WAF1的表達(dá)。但I(xiàn)GFBP7對(duì)于cyclin E的調(diào)控機(jī)制目前尚不清楚，尚不排除IGFBP7作為轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子直接調(diào)控cyclin E表達(dá)的可能。

綜上所述，IGFBP7抑制人乳腺癌MCF－7細(xì)胞增殖的機(jī)制可能與其抑制ERK1/2信號(hào)通路，上調(diào)p53、p21CIP1/WAF1和 p27KIP1，下調(diào) cyclin D1 和 cyclin E表達(dá)，抑制Rb磷酸化有關(guān)，但其具體機(jī)制還有待進(jìn)一步的探討。

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